吳婷婷， 芮志蓮， 徐敏， 邵啟祥

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 溧陽市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 常州 213300)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P．a(chǎn)eruginosa)廣泛分布于自然界、人和動物的體表及腸道中，是一種常見的條件致病菌。銅綠假單胞菌在一般情況下不對健康人群致病，但對于免疫力低下或者缺陷的患者，容易引起嚴(yán)重的感染，甚至危及生命。銅綠假單胞菌同時也是院內(nèi)獲得性感染的重要病原體，由該菌引起的感染約占院內(nèi)感染的10%。在燒傷和腫瘤等特殊病房，以及各種導(dǎo)管與內(nèi)窺鏡的治療與檢查室內(nèi)，銅綠假單胞菌的感染率可高達(dá)30%。由于廣譜抗生素的濫用，銅綠假單胞菌對包括碳青霉烯類在內(nèi)的多種抗生素的敏感性日益下降[1]。近年來甚至出現(xiàn)了泛耐藥的銅綠假單胞菌菌株，它們對除多黏菌素外的抗生素廣泛耐藥，包括青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類和碳青霉烯類。除了常見的耐藥種類外，近年來，研究者還發(fā)現(xiàn)了一種新的耐藥方式，即異質(zhì)性耐藥，如對亞胺培南(imipenem，IMP)異質(zhì)性耐藥的銅綠假單胞菌。臨床治療常依賴于藥敏試驗，然而仍有一部分會治療失敗，這除了與藥代動力學(xué)因素相關(guān)，也可能與細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥相關(guān)[2]。目前對異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌的特征及機制研究較少，本研究對常州地區(qū)臨床分離的銅綠假單胞菌及其亞胺培南異質(zhì)性耐藥的機制進(jìn)行了初步的探討，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

自2013年12月到2017年7月間，從蘇州大學(xué)附屬常州腫瘤醫(yī)院和溧陽市人民醫(yī)院采集的臨床患者痰液、血液、膿液等各類標(biāo)本共4 207例，從中分離獲得310株銅綠假單胞菌。

1.2 試劑

血平板、生理鹽水、青島海博生物生產(chǎn)的250 g MH瓊脂粉、默沙東公司生產(chǎn)的亞胺培南-西司他丁鈉藥用針劑、金壇中天生物醫(yī)藥有限公司提供的10 μg亞胺培南紙片，500 mmol/L的EDTA溶液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat, AORT-0020，美國Gene Copoeia公司)，1%結(jié)晶紫溶液等(批號：416112，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.3 菌譜分析及生物學(xué)特性觀察

將ATCC27853標(biāo)準(zhǔn)菌株(溧陽市疾控中心朱偉贈送)及篩選分離的試驗菌株轉(zhuǎn)種于血平板，35 ℃孵育24 h，用無菌生理鹽水分別稀釋成106、107、108、109、1010CFU/mL等不同濃度的菌懸液。取每個濃度菌懸液10 μL，分別涂布接種于含4、8、16、32和64 μg/mL 亞胺培南的培養(yǎng)基上，35 ℃孵育48 h，然后進(jìn)行菌落計數(shù)，計算耐藥亞群出現(xiàn)頻率并觀察菌落形態(tài)及色素產(chǎn)生情況。

菌譜分析的結(jié)果計算方法:細(xì)菌總量=n×100/1010，其中n為10 μL菌液(濃度為1010CFU/mL)接種于不同濃度的亞胺培南培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)(CFU)，乘以100將μL換算成mL，除以1010為每mL菌液中的細(xì)菌總量(CFU)。

1.4 金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)表型的篩選

按照紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)程序制備0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?，并均勻涂布于MH瓊脂平皿上，貼含10 μg的亞胺培南藥敏紙片兩片，其中一片加入10 μL濃度為500 mmol/L的EDTA，37 ℃溫箱孵育18～24 h后測量兩紙片的抑菌圈直徑。加入EDTA的亞胺培南藥敏紙片抑菌圈直徑比不加EDTA的亞胺培南藥敏紙片抑菌圈直徑增大≥5 mm以上者為MBL表型陽性。

1.5 實時定量PCR檢測細(xì)菌外排泵基因

將單個銅綠假單胞菌菌落接種于2 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，然后用0.1% DEPC水洗滌，4 ℃離心10 min，去上清液。加入1 mL細(xì)菌裂解液裂解細(xì)菌。采用Trizol法，抽提細(xì)菌總RNA，并進(jìn)行D(260/280 nm)值測定。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體積為50 μL，包括：總RNA 4 μg；隨機引物100 ng；5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液8 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNasin(RNA蛋白酶抑制劑)50 U，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶30 U。反應(yīng)條件和時間：37 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。采用SYBGreen實時定量PCR法測定外排泵蛋白MexAB和MexCD的基因。按照試劑公司提供的操作指南進(jìn)行，反應(yīng)體系：緩沖液2.5 μL，上、下游引物各12.5 pmol/L，核酸模板1.0 μL，Taq酶2.5 U，總反應(yīng)體系20 μL。同時設(shè)置空白對照和16 S rRNA質(zhì)控對照。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。加樣完成后，在ABI7300型儀器上進(jìn)行擴(kuò)增。兩種外排泵的PCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，58 ℃ 8 s，72 ℃ 18 s，40個循環(huán)。將檢測的臨界點設(shè)定在PCR 擴(kuò)增過程中熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)(threshold cycle, Ct)值處, 將不同濃度的定量模板的對數(shù)和相應(yīng)Ct值作圖，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 目的基因引物序列

1.6 半定量結(jié)晶紫染色法檢測生物膜

向96孔板加入定量的菌液、肉湯和引導(dǎo)片，培養(yǎng)1 d后室溫下用消毒后移液管加入無菌生理鹽水漂洗3次，固定后自然干燥，然后加入1%結(jié)晶紫染液染色，20 min后漂洗脫色干燥，放入酶標(biāo)儀在490 nm處測定D值。同法分別測定實驗菌株與對照株在培養(yǎng)1、3、5和7 d后的D值，以此來證實生物膜隨時間生長的厚度變化。對照菌株為隨機選擇的36株對亞胺培南完全敏感的銅綠假單胞菌。

1.7 PCR檢測膜孔蛋白OPRD2基因

OPRD2基因引物序列如下，P1：5′-TGTAGATAACTACGATACGGGAG-3′,P2：5′-GCGGTAATTTAACCA-3′，退火溫度53 ℃，產(chǎn)物長度193 bp。反應(yīng)體系： P1、P2 引物各1 μL,Taq酶10 μL,緩沖液7 μL，模板液各1.0 μL，總反應(yīng)體系20 μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 60 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35次,72 ℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相保存。PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與基因庫進(jìn)行序列比對分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用配對資料t檢驗分析36株亞胺培南異質(zhì)性耐藥與36株亞胺培南敏感銅綠假單胞菌的MexAB和MexCD的表達(dá)差異及兩組細(xì)菌生物膜產(chǎn)生水平的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏鑒定結(jié)果

在亞胺培南紙片抑菌環(huán)的邊緣出現(xiàn)了許多菌落(透射光下肉眼可見)，可初步認(rèn)為這些菌落可能是異質(zhì)性耐藥菌落(圖1)。

圖1 銅綠假單胞菌對亞胺培南的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象

根據(jù)VITEK藥敏結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)244株亞胺培南敏感菌株和66株非敏感菌株。由于異質(zhì)性耐藥菌株只出現(xiàn)在敏感菌株中，故在244株亞胺培南敏感的分離菌株中采用KB法篩選，發(fā)現(xiàn)有61個菌落存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，經(jīng)過5次傳代培養(yǎng)，有25株恢復(fù)敏感，同時仍有36株保持耐藥。由此確認(rèn)36株對亞胺培南有異質(zhì)性耐藥，總體檢出率為11.6%。菌譜分析結(jié)果見表2，銅綠假單胞菌對于亞胺培南異質(zhì)性耐藥的變異頻率約在 8.9×10-7～4.5×10-9之間。

表2 菌譜分析

續(xù)表2

2.2 異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌不表達(dá)MBL

雙紙片協(xié)同試驗顯示，36株亞胺培南異質(zhì)性耐藥的銅綠假單胞菌均不產(chǎn)生MBL。

2.3 外排泵基因高表達(dá)于異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌菌株

定時定量PCR顯示，MexAB和MexCD基因在對照菌株中的Ct值分別為15.15±0.64和14.86±1.01。而在36株亞胺培南異質(zhì)性耐藥的銅綠假單胞菌中，MexAB和MexCD的Ct值分別為18.91±3.87，14.54±0.92。這表明MexAB在亞胺培南異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌中的表達(dá)水平明顯高于亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌(t=5.249,P<0.05)，但MexCD外排泵基因表達(dá)在兩類銅綠假單胞菌間無明顯差異(t=1.177,P>0.05)。

2.4 異質(zhì)性耐藥菌株生物膜明顯高于對照菌株

由表3可見，異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌的生物膜形成明顯高于對照組水平(P<0.05)。

表3 半定量結(jié)晶紫染色法實驗結(jié)果 D值

2.5 OPRD2基因檢測結(jié)果

如圖2所示，3號、6號、7號均為基因缺失株。在36株異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌中共檢出膜孔蛋白OPRD2基因缺失株6株，陽性率為16.7%。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；A：銅綠假單胞菌ATCC27853；N：陰性對照大腸埃希菌ATCC25922；P：陽性對照(上海生工提供)；1-7：1-7號菌株

圖2部分膜孔蛋白OPRD2缺失菌株擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

3 討論

異質(zhì)性耐藥是一種特殊類型的細(xì)菌耐藥，常導(dǎo)致臨床檢測錯誤和臨床抗感染治療的失敗，因而引起了學(xué)者們和臨床工作者的廣泛關(guān)注。早期關(guān)于異質(zhì)性耐藥的報道見于葡萄球菌[3]，1997年，日本學(xué)者首次從傳染病患者痰液標(biāo)本中分離出1例對甲氧西林異質(zhì)性耐藥的金黃色葡萄球菌[4]。迄今，已有國家報道了多例萬古霉素異質(zhì)性耐藥的金黃色葡萄球菌[5]，還有碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌[6]。近些年研究表明，鮑曼不動桿菌對多黏菌素和碳青霉烯類[7]，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類[8]都能發(fā)生異質(zhì)性耐藥。歐洲國家也發(fā)現(xiàn)了碳青霉烯異質(zhì)性耐藥的陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌[9-10]。但相對于葡萄球菌，國內(nèi)外對于銅綠假單胞菌的異質(zhì)性耐藥研究較少，且耐藥機制不夠明確。

本次研究中，我們采用KB法在244株敏感菌株中檢測到61株可疑亞胺培南異質(zhì)性耐藥菌株，經(jīng)過5代傳代后，有25株恢復(fù)了敏感，其余36株仍然耐藥，表明部分銅綠假單胞菌菌株的異質(zhì)性耐藥是不穩(wěn)定的。另外，本研究也表明，銅綠假單胞菌對于亞胺培南的異質(zhì)性耐藥頻率介于8.9×10-7～ 4.5×10-9。許磊[11]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌對多黏菌素的異質(zhì)性耐藥率為2×10-6～ 3.5×10-7，大大高于本研究中亞胺培南的異質(zhì)性耐藥概率。美國的Hawley等[12]發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌對多黏菌素異質(zhì)性耐藥亞群的出現(xiàn)頻率為2.11×10-6～ 5.3×10-7。由此可見，碳青霉烯類藥物不易產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥，仍應(yīng)作為治療銅綠假單胞菌的首選類藥物。我們的研究闡明了銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的部分機制。

據(jù)文獻(xiàn)報道[13-16]，銅綠假單胞菌多藥耐藥的機制主要有外排泵、生物膜和產(chǎn)酶的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)在36株對亞胺培南耐藥具有異質(zhì)性的銅綠假單胞菌菌株中，除了外排泵高表達(dá)外，生物膜形成量明顯高于對照組。但不同于一般耐藥，異質(zhì)性耐藥菌株均未檢出MBL，因此銅綠假單胞菌對亞胺培南異質(zhì)性耐藥的機制可能與MexAB外排泵的高表達(dá)及生物膜有關(guān)。也可能正是由于MexAB外排泵的高表達(dá)，銅綠假單胞菌能將藥物泵出菌膜，或者生物膜的出現(xiàn)阻止了藥物的進(jìn)入，從而產(chǎn)生耐藥。在36株異質(zhì)性耐藥菌株中檢出了6株膜孔蛋白OPRD2缺失菌株。有研究顯示96.5%的碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌株存在OPRD2編碼基因的缺失或插入，導(dǎo)致99.3%的菌株對亞胺培南耐藥[17]。Fernández-Cuenca等[18]指出blaADC-29、I-SAba1、ISAba2 和 ISAba3也與碳青霉烯類表型異質(zhì)性耐藥的形成有關(guān)。

總之，銅綠假單胞菌的異質(zhì)性耐藥的機制可能與外膜孔蛋白缺失、外排泵的作用以及生物膜的產(chǎn)生有關(guān)。加強對異質(zhì)性耐藥細(xì)菌的檢測，能更好地指導(dǎo)臨床上抗生素的應(yīng)用。但本次研究篩選到的異質(zhì)性耐藥菌株較少，還需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究，以較為全面地了解銅綠假單胞菌分離株異質(zhì)性耐藥特性及產(chǎn)生機制，從而減少因該類菌株引起的臨床藥敏檢測錯誤，避免臨床抗感染治療的失敗和院內(nèi)感染的發(fā)生。