劉 麒，王闊鵬，于凌嬌，劉倩宏

轉(zhuǎn)化是基因重組中的一項(xiàng)重要技術(shù)，是決定平末端連接效率及建立高質(zhì)量基因文庫的關(guān)鍵。將攜帶目的基因的質(zhì)粒成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有兩種：一種是氯化鈣法，另一種是電轉(zhuǎn)化法。電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓迫使細(xì)胞膜產(chǎn)生孔隙使質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率較高[1]。基因的平末端連接對(duì)轉(zhuǎn)化率要求較嚴(yán)格，需要較高的轉(zhuǎn)化率作為支撐。目前，在不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的影響下，感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化條件都有所不同。為提高平末端連接、轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)而建立較高質(zhì)量的文庫，因此本研究通過比較不同電轉(zhuǎn)化條件下大腸桿菌TG1的轉(zhuǎn)化效率，為后續(xù)噬菌體展示基因文庫的建立奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要儀器

大腸桿菌菌株TG1本室-80 ℃保存；pDJ01質(zhì)粒為梅西大學(xué)Jasna Rakonjac教授惠贈(zèng)，-80 ℃保存；大腸桿菌TG1株購自廣州碧云天生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物有限公司。

LB液體培養(yǎng)液：量取胰蛋白胨2 g，酵母提取物2.0 g，NaCl1.0 g，用去離子水定容補(bǔ)足體積至500 mL。

SOC培養(yǎng)液：在950 mL去離子水中加入胰化蛋白胨20.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl0.5 g，加入10 mL 250 mmol/L KCl溶液，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。用去離子水定容1 L，高壓蒸汽滅菌20 min，備用。使用前加入5 mL滅菌的2 mol/L MgCl2，高壓滅菌后冷卻至60 ℃或60 ℃以下，加20 mL除菌的1 mol/L葡萄糖溶液[2]。

LB固體培養(yǎng)基(含20 μg/mL氯霉素)：稱取胰蛋白胨2 g，酵母提取物2 g，NaCl 1 g，瓊脂糖4 g，用去離子水定容補(bǔ)足體積至500 mL。待蒸汽滅菌后，將培養(yǎng)基放置水浴鍋中，待溫度降至40 ℃左右添加氯霉素以20 μg/mL的終濃度添加于培養(yǎng)基中。

TGL20M離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、電轉(zhuǎn)儀(Bio-rad)、無菌恒溫培養(yǎng)箱(Thermol)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pDJ01質(zhì)粒提取 用接種環(huán)蘸取一定的菌液在新鮮的LB(含20 μg/mL氯霉素)固體培養(yǎng)基上交錯(cuò)劃線，37 ℃ 倒置過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于5 mL LB(含20 μg/mL氯霉素)液體培養(yǎng)基中37 ℃、 200 rpm/min過夜震蕩培養(yǎng)，將菌液離心，利用康為世紀(jì)質(zhì)粒提取盒提取質(zhì)粒。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)粒濃度。

1.2.2 TG1大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制 取出-80 ℃保種的TG1大腸桿菌，用接種環(huán)蘸取一定的菌液在新鮮的LB固體培養(yǎng)基上交錯(cuò)劃線，37 ℃過夜、靜置培養(yǎng)。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)液中，37 ℃，170 rpm/min振蕩過夜培養(yǎng),此即為母液。按母液與LB液體培養(yǎng)液1∶100比例，轉(zhuǎn)接新鮮LB液體培養(yǎng)液中，37 ℃，170 rpm/min振蕩培養(yǎng)，每隔0.5 h取菌液0.5 mL，直至培養(yǎng)9.5 h，取不同時(shí)間點(diǎn)菌液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行，繪制TG1株大腸桿菌生長(zhǎng)曲線圖[3-4]。

對(duì)經(jīng)過培養(yǎng)的菌液用LB液體培養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋，稀釋成10-1～10-13，取不同稀釋度菌液100 μL涂板計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 TG1感受態(tài)細(xì)胞的制備 取2 mL母液轉(zhuǎn)接到200 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)液中，37 ℃、170 rpm/min振蕩培養(yǎng)(振蕩培養(yǎng)時(shí)間及條件根據(jù)1.2.2結(jié)果確定)，冰浴30 min。將冰浴后的菌液分裝至預(yù)冷的無菌離心管中，4 ℃、5 000 rpm/min離心20 min，操作始終保持在冰浴環(huán)境下進(jìn)行。將上清液吸出后，再用10%無菌甘油水輕輕吹打重懸細(xì)胞，重復(fù)洗滌2次后分別用10%無菌甘油水重懸細(xì)胞沉淀。每管100 μL分裝至EP管中， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 電轉(zhuǎn)化 將2 μL pDJ01質(zhì)粒加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞中充分混合，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1 800 V，電容25 μF，電阻200 Ω，0.1 cm電擊杯，進(jìn)行電擊。立刻加入500 μ L LB保護(hù)受損細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到離心管中，再加入400 μ L LB充分吹盡菌體加入到離心管中，37 ℃、170 rpm/min振蕩培養(yǎng) 45 min，用移液槍吸取100 μL涂于LB固體培養(yǎng)基(20 μg/mL氯霉素)，37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，通過生長(zhǎng)的菌落數(shù)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化效率。

1.2.5 TG1菌株在不同生長(zhǎng)階段對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響 通過1.2.2確定的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，選取活化后1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h的TG1菌液，制備感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，條件同1.2.4，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)電轉(zhuǎn)化效率。

1.2.6 感受態(tài)細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 理論上感受態(tài)細(xì)胞的濃度越高其轉(zhuǎn)化率越高，但過高的濃度會(huì)使菌體過于粘稠，不利于質(zhì)粒與菌體混合，反而會(huì)降低其對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率。按1.2.5優(yōu)化的最佳條件制備感受態(tài)細(xì)胞后，將其分裝在4管50 mL預(yù)冷的無菌離心管中，每管約100 μL菌體，分別加入10%無菌甘油水進(jìn)行1∶1、1∶3、1∶5、1∶7倍稀釋，以確定感受態(tài)細(xì)胞制備最佳稀釋濃度。將2 μL pDJ01質(zhì)粒分別與不同稀釋倍數(shù)的感受態(tài)細(xì)胞混合，電轉(zhuǎn)化，其余操作同1.2.4。

1.2.7 轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇時(shí)間及復(fù)蘇液對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 對(duì)電擊后細(xì)胞的復(fù)蘇液的選取及復(fù)蘇時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。將2 μL pDJ01質(zhì)粒與100 μL感受態(tài)細(xì)胞混合，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化操作同1.2.4，電擊后立即加入900 μ L LB液體培養(yǎng)液和SOC培養(yǎng)液，37 ℃、170 rpm/min振蕩培養(yǎng) ，分別在0.75 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。取不同復(fù)蘇液及不同復(fù)蘇時(shí)間的菌液樣本50 μL進(jìn)行涂板，恒溫箱37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。其余操作同1.2.4。

圖1 圖1. pDJ01質(zhì)粒提取結(jié)果1.提取質(zhì)粒pDJ01結(jié)果；2.10000mark(條帶大小從下到上分別為100 bp.250 bp.500 bp.750 bp.1 000 bp.1 500 bp.2 000 bp.3 000 bp.5 000 bp.10 000 bp)

1.2.8 電轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 選用以下三組不同條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化：電壓1 800 V、電容25 μF、電阻200 Ω 、0.1 cm電擊杯；電壓2 500 V、電容25 μF、電阻200 Ω 、0.1 cm電擊杯；電壓3 000 V、電容25 μF、電阻200 Ω 、0.2 cm電擊杯。電轉(zhuǎn)化后操作與1.2.4相同，培養(yǎng)后進(jìn)行觀察。

1.2.9 質(zhì)粒濃度改變對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 分別取100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL不同濃度的pDJ01質(zhì)粒2 μL與100 μL感受態(tài)細(xì)胞充分混合，冰浴靜置5 min進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，操作與1.2.4相同，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)質(zhì)粒濃度改變對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.10 抗生素濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 向LB固體培養(yǎng)基中添加氯霉素使其濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL。利用1.2.8優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化參數(shù)對(duì)其進(jìn)行電轉(zhuǎn)化操作后，分別將其涂布于氯霉素濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上。其余操作同1.2.4，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。

2 結(jié)果

2.1 pDJ01質(zhì)粒提取結(jié)果

pDJ01質(zhì)粒提取結(jié)果見圖1。pDJ01質(zhì)粒大小約為1 500 bp，在預(yù)期位置發(fā)現(xiàn)目的條帶，并估算其濃度約為100 ng/μL。

2.2 大腸桿菌TG1生長(zhǎng)曲線的繪制

分別取活化后不同時(shí)間點(diǎn)TG1菌液，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖2。從圖中可看出， 1.5 h至5 h TG1處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的形態(tài)、染色特性、致病性、抗藥性等生物特征最為典型，TG1生長(zhǎng)曲線的繪制對(duì)于后續(xù)系列轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化至關(guān)重要。

圖2 大腸桿菌TG1生長(zhǎng)曲線

圖3 TG1菌株在不同生長(zhǎng)階段對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 TG1轉(zhuǎn)化時(shí)間及復(fù)蘇液對(duì)轉(zhuǎn)化率影響結(jié)果

圖6 電轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 TG1菌株在不同生長(zhǎng)階段對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響

分別取活化后1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h的大腸桿菌TG1菌液制備感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差異極顯著(p<0.01)，因此在活化后3.0 h時(shí)，其電轉(zhuǎn)化效率最高。

2.4 感受態(tài)細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

取活化后3.0 h菌液制備感受態(tài)細(xì)胞，以10%無菌甘油水稀釋制備好的感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化后確定不同感受態(tài)細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果見圖4。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1組(1∶1倍稀釋)、2組(1∶3倍稀釋)、3組(1∶5倍稀釋)之間結(jié)果無顯著差異(p>0.05), 1組、2組、3組與4組(1∶7倍稀釋)之間結(jié)果差異極顯著(p<0.01)，試驗(yàn)以1∶1倍稀釋濃度為最佳操作條件。

2.5 電轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇培養(yǎng)液及復(fù)蘇時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

選用LB和SOC不同復(fù)蘇液對(duì)電擊后感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果見圖5。用LB復(fù)蘇液復(fù)蘇電擊后細(xì)胞效果明顯優(yōu)于SOC復(fù)蘇液，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異極顯著(p<0.01)。

選取LB復(fù)蘇液后分別搖動(dòng)0.75 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后，從圖5看出并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同復(fù)蘇時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率沒有影響。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異不顯著(p>0.05)，因此試驗(yàn)選用電擊后復(fù)蘇0.75 h。

選取SOC復(fù)蘇液后分別搖動(dòng)0.75 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后，從圖5看出并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異不顯著(p>0.05)，不同復(fù)蘇時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率沒有影響。因此試驗(yàn)選用電擊后復(fù)蘇0.75 h。

2.6 電轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

分別設(shè)定三組不同電擊參數(shù)及不同厚度電擊杯，確定其對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響，結(jié)果見圖6。從圖中可以看出第1組即電壓1 800 V，電容25 μF，電阻200 Ω，電轉(zhuǎn)化效率最高，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1組與2組、3組間差異極顯著(p<0.01)，為最佳電轉(zhuǎn)化參數(shù)。

2.7 質(zhì)粒濃度的改變對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

選取100 ng/mL、 50 ng/mL、25 ng/mL不同濃度的pDJ01質(zhì)粒2 μL與100 μL感受態(tài)細(xì)胞充分混合后，從圖7看出100 ng/mL pDJ01質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率最佳，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1組與2組、3組間差異極顯著(p<0.01)，為最佳質(zhì)粒濃度。

2.8 抗生素濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

向LB固體培養(yǎng)基中分別添加10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL濃度的氯霉素，從而確定不同濃度抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果見圖8，抗生素濃度為20 μg/mL時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，恰好適宜轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞增殖并抑制雜菌生長(zhǎng)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1組與2組、3組間差異極顯著(p<0.01)，在氯霉素含量為20 μg/mL的條件下，轉(zhuǎn)化效率最高。

圖7 質(zhì)粒濃度的改變對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

圖8 抗生素濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

3 討 論

感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)常規(guī)操作，常見轉(zhuǎn)化方法包括電轉(zhuǎn)化法、MgCl2-DMSO法、LiAc和 CaCl2法等，而電轉(zhuǎn)化法相對(duì)成本較低、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率較為理想，轉(zhuǎn)化條件因?qū)嶒?yàn)室不同，結(jié)果也不盡一致，而且不同的菌株對(duì)電轉(zhuǎn)化的反映程度不同，所用的轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化條件一定不同[5-8]。研究對(duì)大腸桿菌TG1轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了探索，為后續(xù)平端連接以及建庫打下良好的基礎(chǔ)。

電壓是決定電轉(zhuǎn)化效率的重要參數(shù)，通過運(yùn)用高電壓將細(xì)胞的細(xì)胞壁電擊出可以使大分子物質(zhì)通過的小孔。由于利用強(qiáng)電壓對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電擊將會(huì)對(duì)細(xì)胞造成極大的損傷，在此過程中會(huì)使較多的細(xì)胞受損死亡以及生存受限而難以得到高轉(zhuǎn)化率，并且死亡的菌體會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)菌的生存空間從而限制其生長(zhǎng)。因此，嚴(yán)格選擇適宜的電壓是進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)，達(dá)到預(yù)期效果和必需條件的重點(diǎn)。經(jīng)過試驗(yàn)摸索最適電壓為1 800 V，此電壓電擊轉(zhuǎn)化率最好。

研究對(duì)SOC、LB兩種復(fù)蘇液的效果也進(jìn)行了比較。SOC復(fù)蘇液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量較LB更加豐富，但其對(duì)電擊后細(xì)菌的生長(zhǎng)并沒有明顯促進(jìn)作用，即使在復(fù)蘇過程中，菌體沉淀量遠(yuǎn)多于LB復(fù)蘇液，事實(shí)上并沒有在轉(zhuǎn)化率上體現(xiàn)出來，分析其原因可能是因?yàn)镾OC復(fù)蘇液豐富的營(yíng)養(yǎng)，相對(duì)而言只加速了未受損細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，而對(duì)轉(zhuǎn)化率則沒有明顯促進(jìn)作用[9]。這與黃學(xué)娟,張金迪,張壯等人的研究不符，其原因可能是由于試驗(yàn)條件與環(huán)境不同而造成的差異。

4 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)室條件下大腸桿菌TG1株感受態(tài)細(xì)胞最優(yōu)制備條件為：TG1大腸桿菌母液按照1∶100導(dǎo)入新鮮LB液體培養(yǎng)液后， 37 ℃、170 rpm/min活化培養(yǎng)3 h，感受態(tài)終濃度1.4×107，復(fù)蘇液選用LB液體培養(yǎng)液，復(fù)蘇時(shí)間為3.0 h；最佳電轉(zhuǎn)化條件:為電壓1 800 V，電容25 μF，電阻200 Ω，pDJ01質(zhì)粒濃度為100 ng/μL，氯霉素濃度20 μg/mL。