余 蕾，閻光宇，孫繼鵬，易瑞灶，蘇永全

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)，化學名金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是一類普遍存在于生物體內(nèi)的、低分子量(2-7 kD)的、富含半胱氨酸(20%-30%)、不含芳香族氨基酸和組氨酸的一類金屬結合蛋白質(zhì)。MT可被金屬、細胞因子、有機化學藥物和應激、荷爾蒙等誘導，具有維持生物體內(nèi)金屬含量動態(tài)平衡和重金屬解毒作用雙重機制，且具有清除自由基和抗輻射、提高機體免疫力、增強機體抗應激能力等多種主要的生物學作用[1-3]。因此，MT在食品保健、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、生物工程、環(huán)保等領域得到了廣泛的應用。

目前，國內(nèi)市場上常見的MT多數(shù)是從兔肝臟中提純[4]，提取工藝繁復，產(chǎn)量極低，致使MT的價格極其昂貴(純度在 95% 以上價格為 45 000～50 000 元/g)，MT原料來源已成為制約該領域發(fā)展的瓶頸之一，從而使其應用和研究受到限制。利用益生菌基因重組技術大規(guī)?；a(chǎn)制備 MT 是解決其來源限制瓶頸的熱點研究方向。

畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)具有優(yōu)良特性，是目前廣泛應用的微生物表達系統(tǒng)之一，作為真核生物，其不僅具備原核表達系統(tǒng)的繁殖速度快、操作簡單及價格低廉、外源蛋白表達量高等優(yōu)點，還能夠?qū)ν庠吹鞍走M行翻譯后加工、折疊及修飾，自身分泌的蛋白質(zhì)少便于分離純化，更適用于大批量發(fā)酵生產(chǎn)。目前，已有多種外源基因在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中成功地重組表達[5-7]。底棲雙殼類海洋動物為濾食性生物，對重金屬有較強的生物富集能力，其體內(nèi)MT基因?qū)χ亟饘倬哂懈呙舾械膽ば猍8-10]，且與環(huán)境中金屬濃度具有一定的相關性。相對于陸地源 MT，海洋源 MT 具有獨特的化學結構和特殊的生物活性。本研究采用畢赤酵母 GST115 菌株表達海洋源 MT。畢赤酵母菌株 GST115 利用強效的醇氧化酶1(AOX1)啟動子，已成功高效表達了多種外源蛋白，且其與酵母基因組整合的機理決定酵母多拷貝重組子的出現(xiàn)。本研究旨在解決制約MT產(chǎn)業(yè)發(fā)展原料來源瓶頸，應用基因重組技術，將褶牡蠣(Ostrea plicatula)內(nèi)臟團中克隆得到的金屬硫蛋白基因全長序列 OpMT，插入到表達載體 pPICZαA -SUMO 的相應位點，并轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌GS115中，擬構建安全高效分泌表達的重組畢赤酵母菌MT基因工程菌。以期能獲得具高安全性、高產(chǎn)量和高活性的高純海洋源 MT 蛋白，解決 MT 原料來源限制的瓶頸，為以后開發(fā)天然、高效海洋源重金屬解毒劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和主要試劑 本實驗室所用菌株和質(zhì)粒見表1。主要試劑見表2。

表1 質(zhì)粒和菌株

表2 主要試劑

1.2 試驗方法

1.2.1 融合分泌表達載體pPICZαA-SUMO-OpMT的構建 根據(jù)NCBI GeneBank中褶牡蠣金屬硫蛋白基因OpMT序列(登錄號:KP875559)，設計引物(F1：TGG ACC GGA TGT AAT GTG GT /R1：TTG GGT CCT TTG TTA CAC GC)，從褶牡蠣內(nèi)臟團總RNA中擴增得到目的基因序列。連接至克隆載體pMD-19，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α 中，送至上海生物工程技術公司進行序列測定。酶切(BamHI/SmaI)后連接至pPICZαA-SUMO 表達載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α細胞，抗生素(100 μg/mL 氨芐青霉素Amp)平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并加以驗證。

1.2.2 畢赤酵母重組工程菌構建和篩選利用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒 pPICZαA-SUMO-OpMT轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌 GST115中，利用含有不同濃度抗生素(博來霉素)的MD 平板進行初步篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子菌株，命名為 GST115/pPICZαA- SUMO-OpMT (圖 1)。

圖1 重組質(zhì)粒 pPICZαA- SUMO-OpMT 的構建

篩選得到的重組酵母菌株用 YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至同一生長周期，取 2 mL 菌液依次接種在0, 0.25, 0.50, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0 mg/mL 博來霉素的 YPD 平板上。在耐受高質(zhì)量濃度博來霉素的 YPD 平板上篩選陽性高拷貝GST115/pPICZαA- SUMO-OpMT 重組酵母。

Mut+表型的重組菌株一般是由于 SalI 線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化 GS115 后，大多數(shù)在 HIS4 位點發(fā)生了重組。可以利用MMH 和 MDH平板進行區(qū)分檢測。因此，進一步對高濃度博來霉素的 YPD 平板上的 GST115//pPICZαA -SUMO- OpMT 重組酵母菌株進行甲醛利用型篩選Mut+型，分別利用含有博來霉素的 MMH 和 MDH 平板篩選。在 MMH 平板上很小或者不長，而在 MDH 平板上能夠正常生長的為 Muts 型，其余為 Mut+ 型。同時挑取單菌落進行PCR 擴增鑒定(引物 F2：ATG TCT GAT CCA TGT AAC /R2：TC ATT TCT TAC AGA CAC ATC)。

1.2.3 融合蛋白誘導表達和分離純化 100 mL GST115/pPICZαA- SUMO-OpMT 于BMGY 菌液擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30 ℃，24 h ， 220 r /min 振蕩培養(yǎng)至OD600 值為 6.0，再轉(zhuǎn)入 BMMY 培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，加入0.5% 甲醛誘導，每 24 h 補加1次甲醇，分別在 2, 4, 6, 8 h 分別離心收集發(fā)酵液上清，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳定性，分離膠 12%，濃縮膠 5%。另一組空白畢赤酵母菌 GS115作為對照。電泳結束后凝膠染色 4-6 h，將脫色后的凝膠保存于去離子水中，用 Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

對發(fā)酵液進行His-tag標簽親和純化。首先平衡鎳柱(TBS pH 8.0)，上樣，設流速為1 mL/min，之后用含有50 mmol/L 咪唑的TBS(pH 8.0)洗滌，最后用含有300 mmol/L 咪唑的TBS(pH 8.0)洗脫目的蛋白。收集洗脫峰值，分別進行目的蛋白定性檢測(的SDS-PAGE 凝膠電泳)和定量檢測(Bradford method)。

1.2.4 融合蛋白的 Western blotting 鑒定 將重組畢赤酵母工程菌誘導表達2, 4, 6, 8 h 后的發(fā)酵液和空白對照組(畢赤酵母菌 GS115)的發(fā)酵液，經(jīng) TCA 沉淀后進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入His 抗體，用 Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 褶牡蠣金屬硫蛋白HPLC檢測 收集菌液(7 000 r/min 10 min)，水浴(80 ℃/5 min)， 離心取上清(12 000 r/min 10 min)。進行MT含量測定，采用HPLC方法測定其中-SH含量進行MT間接定量[11]。標樣為兔肝MT，圖7(A)為色譜條件下得到的兔肝MT標樣色譜圖，MT保留時間為7.3～7.7 min。

1.2.6 融合蛋白活性檢測 配置含有不同濃度CdCl2的 YPD固體培養(yǎng)基平板(0, 50, 100, 200, 500, 700 μmol/L)，取100 μL OD600為4.0的畢赤酵母菌重組OpMT工程菌分別均勻涂布于上述平板上，同時以畢赤酵母菌GS115菌株為對照組，30 ℃ 倒置培養(yǎng)12-16 h 觀察菌落生長情況。

圖2 融合表達載體pPICZαA-SUMO-OpMT的酶切鑒定注：為SUMO-OpMT表達載體的酶切圖；M：DNA Marker；1：表達質(zhì)粒雙酶切

2 結果與分析

2.1 融合表達載體的構建

PCR 擴增褶牡蠣內(nèi)臟團總 RNA 得到約為 324 bp的目的基因片段 OpMT 后，與SUMO 基因(約660 bp)一起經(jīng)酶切連接至融合表達載體 pPICZαA，得到構建重組質(zhì)粒 pPICZαA-SUMO-OpMT。該質(zhì)粒的酶切驗證見圖 2。

2.2 高效分泌表達 OpMT 重組工程菌篩選

目的基因整合進畢赤酵母，His+轉(zhuǎn)化子出現(xiàn) 1%-10% 概率的多拷貝插入，整合了多拷貝表達的重組酵母，有利于高效表達外源蛋白?？衫每股?博來霉素)濃度梯度法進行篩選，耐受抗生素(博來霉素)濃度越高，越容易篩選出多拷貝表達的重組酵母菌。設置7個濃度梯度(0.25-4.0 mg/mL)的博來霉素平板篩選，到耐受4.0 mg/mL博來霉素的 GST115/pPICZαA-SUMO-OpMT 重組酵母菌株(見圖3)，表明本研究篩選得到酵母基因組 DNA 上整合了多拷貝目的基因 MT 表達單元的重組酵母菌。

將篩選得到的重組酵母菌株經(jīng)PCR擴增(F1：TGG ACC GGA TGT AAT GTG GT /R1：TTG GGT CCT TTG TTA CAC GC)后送至上海生物工程技術公司進行序列測定。

圖3 高拷貝重組畢赤酵母菌株的篩選(圖中數(shù)據(jù)為 Zeocin 濃度(mg/mL)

圖4 重組酵母工程菌甲醛利用型篩選

通過含博來霉素的 MMH 和 MDH 平板篩選，在MMH 平板上需找到 2 株甲醛利用型(Mut+型)的 GST115/pPICZαA-SUMO-OpMT 重組酵母菌株(圖 4)。

2.3 重組蛋白的誘導表達、分離純化和Western blotting 鑒定

高拷貝甲醛利用型 GST115/pPICZαA-SUMO-OpMT 菌液進行甲醛擴大誘導培養(yǎng)(1 L)，培養(yǎng)條件：30 ℃，8 h，0.5% 甲醛，2, 4, 6, 8 h 分別離心(12 000 r/min，4 ℃，30 min)收集發(fā)酵液上清，利用 His-tag 標簽親和純化 SUMO-OpMT 融合蛋白，Bradford method 分析純化得到融合蛋白結果表明，蛋白純度在 95% 以上，目的蛋白得率0.436 mg/mL。

將收集得到純化蛋白進行SDS-PAGE 電泳分析和 Westernblotting (His-Tag 單抗)鑒定(圖5)。以未轉(zhuǎn)入表達載體的 GST115畢赤酵母菌培養(yǎng)液為空白對照。分析圖 5 (左圖和右圖)發(fā)現(xiàn)在 23 kD(其中 OpMT 編碼蛋白為10.5kD)位置分別出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，說明多拷貝融合蛋白在宿主菌中得到了表達，且融合蛋白為可溶形式表達，表達量并隨著誘導時間延長增加。

圖5 GST115/pPICZαA-SUMO-OpMT 的 SDS-PAGE 電泳檢測(左)和Western Blotting 鑒定(右)M: 蛋白 Marker; ?. 未轉(zhuǎn)化(陰性對照); 紅色箭頭指示目的蛋白

2.4 重組畢赤酵母菌發(fā)酵液中OpMT的HPLC檢測

以兔肝MT為標樣，兔肝MT標品(0.1 mg/mL)和畢赤酵母菌重組工程菌發(fā)酵液HPLC結果見圖6。兔肝MT目的峰的保留時間為7.3～7.7 min。結果顯示，畢赤酵母菌重組工程菌發(fā)酵液在7.7 min有峰出現(xiàn)，說明畢赤酵母重組工程菌發(fā)酵液中含有目的蛋白，畢赤酵母菌重組工程菌成功表達了目的蛋白OpMT，表達量為0.37 mg/mL。

圖6 兔肝MT標品(A)和畢赤酵母重組工程菌發(fā)酵液(B)HPLC色譜圖

2.5 褶牡蠣金屬硫蛋白的活性檢測

將含有SUMO-OpMT質(zhì)粒的畢赤酵母菌重組工程菌和不含SUMO-OpMT質(zhì)粒的畢赤酵母菌空載體分別涂布于含有不同濃度CdCl2的培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12-16 h后發(fā)現(xiàn)(圖7)，隨著CdCl2濃度的增加，平板上菌落數(shù)減少。當CdCl2的濃度達到100 μmol/L時，MT重組工程菌在CdCl2的濃度為50 μmol/L的平板上生長良好，在CdCl2的濃度為100 μmol/L的平板上生長較差，在CdCl2的濃度為200 μmol/L的平板上未能檢測到，即MT重組工程菌的最大耐受CdCl2的濃度為100 μmol/L，而空載體在CdCl2的濃度為50 μmol/L的平板上生長較差，,在CdCl2的濃度為100 μmol/L的平板上未能檢測到菌落。說明含有SUMO-OpMT的重組畢赤酵母菌工程菌對重金屬鎘的耐受能力增強。

圖7 YPD固體培養(yǎng)基上重組工程菌對鎘的耐受能力

3 討 論

利用基因重組和發(fā)酵技術制備重組蛋白是目前獲取大量外源蛋白的首選。目前，國內(nèi)外對金屬硫蛋白基因工程方面研究大多集中在原核表達系統(tǒng)[11]，其應用也多關注于環(huán)境治理和修復以及微生物解毒[12-13]，對 MT 的工業(yè)化應用關注較少，具有工業(yè)化生產(chǎn)價值的基因工程菌株報道更是極少。本課題組前期研究利用 E. coli 高效表達了海洋源 MT，但是表達的蛋白仍以包涵體的形式存在。這與鄧小亮、He Y等報道一致[14-16]。另外，本課題組前期研究還運用枯草芽孢桿菌作為宿主[17]，成功實現(xiàn) SUMO(small ubiquitin-related modifier)與海洋源 MT 的融合分泌表達，并得到高純度的、有活性的可溶性目的蛋白，但表達量較低，仍無法滿足 MT 的工業(yè)化生產(chǎn)要求。

畢赤酵母作為真核宿主菌不僅具有原核生物的優(yōu)點，有利于低成本大規(guī)模生產(chǎn)，同時，可高表達有生物學活性的分泌型功能性外源目的蛋白、極少分泌自身蛋白、不含內(nèi)毒素、使用安全的優(yōu)點，成為實驗室研究及商業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的新寵，具有極好的生產(chǎn)應用前景。畢赤表達系統(tǒng)作為生產(chǎn)外源蛋白的重要宿主菌已成功表達多種蛋白(其中一些產(chǎn)物已應用于臨床試驗，包括酶、膜蛋白、抗原、抗體和調(diào)節(jié)蛋白等[18-20])，但未見有利用畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)海洋源 MT 表達的報道。本研究以畢赤酵母 GS115為宿主菌，成功實現(xiàn) SUMO 與海洋源 MT 在畢赤酵母菌 GS115 中融合分泌表達，并得到高表達的、有活性的可溶性目的蛋白，使海洋源 MT 具有極大的應用于實際工業(yè)生產(chǎn)潛能，為天然高效重金屬生物解毒劑的成功開發(fā)和推廣提供理論依據(jù)。

當前，畢赤酵母菌株 GST115 成功、高效表達多種外源蛋白多依賴 AOX1 啟動基因，而 AOX1 為甲醇依賴型啟動子，所以在培養(yǎng)過程中存在一定火災隱患。因此， GAP、FLD1、PEX8、PGAP 和 YPT1 等不以甲醇為唯一誘導物的啟動子具有更大吸引力，也將是本研究下一步研究的重點。