張 浩，郭虹彩，馬文奎，曹金元

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442）

目前，動物細(xì)菌性疾病十分普遍，嚴(yán)重危害我國畜牧業(yè)的發(fā)展。在基層疾病診療過程中，大量使用抗菌藥物的情況極其普遍，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增強，甚至個別養(yǎng)殖戶在飼料中添加多種抗菌藥以減少疾病的發(fā)生。由于長期濫用抗生素致使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，造成養(yǎng)殖成本增加，畜產(chǎn)品存在藥物殘留，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟效益，同時危及人類的健康。在治療畜禽疾病時，通過藥敏試驗判斷抗生素藥物對病原微生物抑菌效果，從而在最短的時間內(nèi)找出最有效的抗菌藥物，解決生產(chǎn)實踐中的實際問題，在臨床上可以防止濫用抗生素［1］。為了節(jié)約藥敏試驗成本，該試驗選取常用的抗菌藥物，按照不同的濃度梯度制成藥敏紙片來檢測大腸桿菌對藥物的敏感度，并與市場上銷售的藥敏紙片進行對比，從而建立一種簡單快速制備藥敏紙片的方法，有效地指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌藥物：試驗選取獸醫(yī)臨床上常用的青霉素G、卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星、鏈霉素、頭孢噻呋鈉6種抗菌藥物。

1.1.2 培養(yǎng)基：選擇營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （批號：20180305）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：20180420）3 種培養(yǎng)基用于大腸桿菌［2］藥敏測試。培養(yǎng)基均購于北京天壇生物制品股份有限公司，其制備按廠家提供的說明方法進行。

1.1.3 試驗菌種：大腸桿菌菌株采購于中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.4 試驗器材：數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 （HPX-9272MBE，上海博迅實業(yè)有限公司）、超凈工作臺（VS-1300L-U，蘇州安泰）、電子天平（FA2204B，上海佑科儀器儀表有限公司）、微量移液器、手提式不銹鋼蒸汽消毒器（YXQ-LS-18SI，上海博迅實業(yè)有限公司）、海爾冰箱（BCD-322WCKGN33A2S0C）、90 mm培養(yǎng)皿、濾紙、涂布器、不銹鋼打孔器。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物的配制：按照廠家推薦藥物治療量［3］，制備治療量（標(biāo)記 1×）、2 倍治療量（標(biāo)記 2×）和4倍治療量（標(biāo)記4×）的抗菌藥物原液，過濾除菌后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紙片的制備：利用打孔器將110 mm的定性濾紙打成直徑為6 mm［4］的圓形小紙片，放入清潔干燥的青霉素空瓶中，每瓶放入50片，用牛皮紙包好瓶口并用小線扎緊，高壓滅菌（121℃，15 min），烘干，密封備用。

1.2.3 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配制：作為溶劑起溶解、保護藥品的作用，參照《培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》［5］配制 PBS。

1.2.4 藥敏紙片的制備：在無菌條件下（超凈工作臺要求的環(huán)境），分別吸取不同濃度的藥液0.5 mL加入裝有紙片的青霉素瓶中，用牛皮紙密封瓶口，浸泡1 h，讓藥液被紙片充分吸凈；然后將紙片散開放入滅菌的培養(yǎng)皿中，無菌室擱置過夜，待紙片完全干燥后，收集在青霉素瓶內(nèi)，密封，貼好標(biāo)簽，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果觀察：利用超凈工作臺的工作環(huán)境，用接種環(huán)挑取大腸桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后取出，輕輕振蕩使菌液均勻、混濁；用微量移液器吸取0.5 mL，注入做好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，然后用涂布器將菌液均勻推開；待菌液被培養(yǎng)基吸收后用滅菌鑷子將制備好的藥敏紙片貼在培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿內(nèi)貼5個不同的紙片（中間1片，周圍4片）。同時，按上述方法將從市場上購買來的標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片也貼于涂有大腸桿菌的培養(yǎng)皿中做對比。將培養(yǎng)皿放入電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h后取出，用直尺測量抑菌圈直徑，測量3次取其平均值，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)抑菌圈直徑大小作為判斷藥物敏感程度標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑越大說明細(xì)菌對該藥物的敏感性越高［6］。各種抗菌藥物的判斷標(biāo)準(zhǔn)［7］見表 1。

表1 不同抗菌藥物抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

不同濃度抗菌藥物的自制藥敏紙片和市售藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌效果［8］見表2。由表2可知，3個不同濃度的青霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑均為0，青霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；2倍治療量、4倍治療量的卡那霉素自制藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑均為18 mm （敏感），市售卡那霉素藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑為21 mm（敏感），2倍治療量、4倍治療量的卡那霉素自制藥敏片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；3個不同濃度的慶大霉素自制藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑均大于15 mm（敏感），市售慶大霉素藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑為15 mm（敏感），慶大霉素自制藥敏片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；3個不同濃度的氧氟沙星自制藥敏紙片與市售藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑均小于12 mm（耐藥），氧氟沙星自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果一致。3個不同濃度的鏈霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑均小于11 mm（耐藥），鏈霉素自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果一致；3個不同濃度的頭孢噻呋鈉自制藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑均小于14 mm（耐藥），而頭孢噻呋鈉市售藥敏紙片對大腸桿菌的抑菌圈直徑均為16 mm（中度敏感），頭孢噻呋鈉自制藥敏紙片與市售藥敏紙片抑菌效果不一致。

表2 抗菌藥物對大腸桿菌的抑菌效果

由以上結(jié)果可以得出，該試驗自制的藥敏紙片是成功的。

3 討論

①由試驗結(jié)果可以看出，部分自制藥敏紙片測量的抑菌圈直徑明顯小于市售的藥敏紙片，原因可能是自制藥敏紙片所含藥液濃度過低、涂菌不均勻或涂菌過厚所致［9］。目前市場上銷售劣質(zhì)獸藥的現(xiàn)象比較嚴(yán)重，有些藥物濃度達不到國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，藥液濃度低，自然抑菌效果就差。

②藥敏試驗中菌液濃度的控制很重要。通過試驗，觀察到同樣的操作方法，若每次涂布的細(xì)菌沒有經(jīng)過比濁管比對［1］，它所產(chǎn)生的抑菌圈直徑會有差異，影響藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確性。

③由于部分藥物臨床上用量較少，稱量時容易造成結(jié)果出現(xiàn)誤差。該試驗在稱量該類藥品時先擴大藥量，然后進行倍數(shù)稀釋，以減少誤差。

④藥敏紙片和藥液制備過程中，要做到細(xì)致認(rèn)真，只有這樣才能保證試驗結(jié)果盡可能精確。制備好的藥敏紙片置入青霉素瓶中，高壓滅菌后存放-20℃保存?zhèn)溆?，用畢及時放回，通?？梢员４?年。避免反復(fù)凍融藥敏紙片，從而減少試驗結(jié)果的誤差。