袁曉文， 趙學(xué)峰， 邱 銓， 羅子源

(廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 528200)

冠心病是一種由冠狀動脈血管發(fā)生粥樣硬化而造成血管腔狹窄或阻塞，引起心肌損傷的常見心臟病。隨著社會的發(fā)展，人們生活水平的提高，冠心病的發(fā)病率居高不下，實行預(yù)防措施可以有效降低病死率。氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林，能夠有效地預(yù)防不良心血管事件的發(fā)生。但是，仍然有不少患者在給予常規(guī)劑量治療后發(fā)生冠狀動脈缺血事件，這種現(xiàn)象稱作氯吡格雷抵抗(CR)[1]。CYP2C19是主要的細(xì)胞色素P450藥物代謝酶之一，和氯吡格雷的代謝密切相關(guān)。目前研究表明，CYP2C19基因存在多態(tài)性，同時這種多態(tài)性分布存在明顯的地區(qū)和種族間的差異[2]。CYP2C19基因的野生型是CYP2C19*1/*1，其產(chǎn)物具有完全的催化活性；在中國漢族人群中，主要突變的等位基因是CYP2C19*2和CYP2C19*3，導(dǎo)致酶失去催化活性。根據(jù)藥物代謝速率快慢和基因型分型，可將其分為3種類型。正常野生型表型為快代謝型；突變雜合子表現(xiàn)為中間代謝型；突變純合子表現(xiàn)為慢代謝型。由于不同代謝表型的個體間存在代謝速度的差異，血藥濃度也呈個體化差異。通過對患者進(jìn)行CYP2C19基因分型，判定患者藥物代謝速度，合理調(diào)節(jié)藥物的劑量，可以提高氯吡格雷的使用有效性，減少不良反應(yīng)。目前，對廣東佛山地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性研究鮮有報道，因此，本研究選擇佛山地區(qū)漢族冠心病患者為研究對象，探討該地區(qū)冠心病患者CYP2C19基因的多態(tài)性分布特征，并比較其與廣東其他地區(qū)人群之間分布的差異，為本地區(qū)漢族人群冠心病患者及需要使用CYP2C19基因代謝藥物患者的臨床個體化用藥提供理論依據(jù)，減少不良心血管事件和藥物反應(yīng)的發(fā)生。

1 資料與方法

1．1一般資料 納入的研究對象為2016年1月至2017年9月本院冠心病患者1 083例，其中男775例，女308例。所有入選對象均來自廣東佛山地區(qū)常住居民，相互之間無親緣關(guān)系，無家族遺傳病史，愿意參加本項研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤，嚴(yán)重心功能不全，急慢性肝、腎病變，短期內(nèi)有外傷或外科手術(shù)及拒絕參加的患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1．2儀器與試劑 基因組提取試劑盒，CYP2C19基因檢測試劑盒，全自動雜交儀和生物芯片識讀儀(上海百傲科技有限公司)，Veriti 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)，干式恒溫器(杭州奧盛公司)，高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，渦旋振蕩器(江蘇海門其林貝爾儀器廠)。

1．3方法

1．3．1DNA提取 所有患者均于清晨空腹采集前臂靜脈全血2 mL，置于EDTA抗凝管內(nèi)，根據(jù)血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。DNA標(biāo)本-20 ℃保存，凍融不超過3次,1周內(nèi)提取DNA。

1．3．2PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 L，包括：CYP2C19擴(kuò)增液19 L、反應(yīng)液A 1 L、DNA模板5 L。擴(kuò)增條件為50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物1和擴(kuò)增產(chǎn)物2置于2～8 ℃保存。

1．3．3雜交顯色 雜交：按照產(chǎn)品說明書，依次加入預(yù)雜交液、雜交反應(yīng)液、洗脫液、抗體液、顯色液。結(jié)果判讀：將玻璃芯片板和雜交產(chǎn)物放入芯片識讀儀。利用ArrayDoctor軟件自動掃描、分析雜交結(jié)果。根據(jù)說明書判斷CYP2C19基因型所對應(yīng)的代謝表型?；蛐团c代謝型的對應(yīng)關(guān)系：*1/*1(636GG、681GG)為快代謝型；*1/*2(636GG、681GA)、*1/*3(636GA、681GG)為中代謝型；*2/*2(636GG、681AA)、*2/*3(636GA、681GA)、*3/*3(636AA、681GG)為慢代謝型。

1．3.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1佛山地區(qū)漢族人群CYP2C19基因型及代謝型分布 在1 083份檢測標(biāo)本中，CYP2C19基因型分布由多到少分別為*1/*1、*1/*2、*2/*2、*1/*3、*2/*3、*3/*3，分別占患者總數(shù)的40.90%、39.8%、9.05%、5.54%、4.34%、0.37%。檢測出CYP2C19的3種代謝型，快代謝型(*1/*1)占40.90%，中間代謝型(*1/*2、*1/*3)占45.34%，慢代謝型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)占13.76%。CYP2C19*1、*2及*3等位基因的頻率分別為63.57%、31.12%、5.31%。

表1 不同性別的患者CYP2C19基因型及代謝型分布[n(%)]

表2 不同年齡段患者CYP2C19基因型及代謝型分布[n(%)]

續(xù)表2 不同年齡段患者CYP2C19基因型及代謝型分布[n(%)]

2.2不同性別冠心病患者CYP2C19基因型與代謝型頻率分布特點 本研究將患者分為男、女兩個組，結(jié)果顯示，男、女患者CYP2C19基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.303，P=0.140)，代謝型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.335，P=0.114)。見表1。

2.3不同年齡段患者CYP2C19基因型與代謝型分布特點 本研究將1 083例患者分為5個年齡段，分別是≤40歲、>40～50歲、>50～60歲、>60～70歲、>70歲。結(jié)果顯示，不同年齡段患者CYP2C19基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.520，P=0.018)，代謝型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.504，P=0.386)。見表2。

3 討 論

氯吡格雷是一種前體藥物，需要經(jīng)過小腸的吸收和肝臟中CYP2C19酶的氧化和水解后才能轉(zhuǎn)化為有活性的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生抗血小板聚集的作用[3]。CYP2C19基因具有很多SNP位點，CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因是亞洲人群中最主要的功能缺失型。CYP2C19*2是外顯子5的第681位點堿基缺失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄蛋白的剪切突變失活，使蛋白合成提前終止，從而喪失了酶催化活性；CYP2C19*3是外顯子4的第636位點堿基突變，構(gòu)成1個終止子破壞轉(zhuǎn)錄蛋白的活性，導(dǎo)致蛋白合成被提前終止，使酶失去活性。慢代謝型患者，藥物的療效和不良反應(yīng)隨基因型不同而不同[4]。所以，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)對氯吡格雷發(fā)布黑框警告：在氯吡格雷低反應(yīng)的患者中進(jìn)行CYP2C19基因型測定，判斷CYP2C19功能，對氯吡格雷代謝不良者，建議增加劑量或更換其他抗凝血藥物。

此外，CYP2C19還參與了抗抑郁、抗真菌、抗癲癇、質(zhì)子泵抑制劑等藥物代謝[5-7]，快代謝型代謝藥物快，不容易發(fā)生不良反應(yīng)；慢代謝型代謝藥物慢，藥物易蓄積，容易發(fā)生不良反應(yīng)。因此，如果是快代謝型的患者，用相關(guān)藥物時可以適當(dāng)增大劑量，確保有效需要濃度，而慢代謝型患者，應(yīng)降低劑量或者更換非CYP2C19基因代謝的藥物，避免藥物的不良反應(yīng)。目前，對佛山地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性研究鮮見報道，因此，本研究選擇佛山地區(qū)漢族冠心病患者為研究對象，探討本地區(qū)冠心病患者CYP2C19基因的多態(tài)性分布特征，并分析其與廣東其他地區(qū)人群之間分布的差異。

CYP2C19的基因多態(tài)性分布存在明顯的地區(qū)和種族間的差異。中國人群中CYP2C19*2等位基因頻率約為30%，顯著高于白人(約15%)和美國黑人(約18%)；CYP2C19*3等位基因頻率在中國人、白人和美國黑人別為5.0%、4.0%、0.4%[8]。本研究1 083份標(biāo)本中，患者CYP2C19*1、*2及*3等位基因的頻率分別為63.57%、31.12%、5.31%，與上述報道相似。CYP2C19快代謝型443例占40.90%；中間代謝型491例占45.34%,慢代謝型149例占13.76%，也就是說佛山地區(qū)的患者有將近60%會存在或輕或重的氯吡格雷抵抗現(xiàn)象。中間代謝型的患者由于氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物的血藥濃度偏低，而需增加維持劑量來達(dá)到治療效果；慢代謝型患者的氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物水平較低，則需要改用或者聯(lián)合其他血小板拮抗劑。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19代謝型與性別和年齡沒有關(guān)系(P>0.05)，與文獻(xiàn)[9-10]報道一致。本文還研究了廣東不同地區(qū)漢族人群之間CYP2C19基因多態(tài)性的分布是否存在差異，結(jié)果顯示，佛山地區(qū)代謝型分布與廣州(快代謝型、中間代謝型、慢代謝型分別為36.8%、47.7%、15.5%)[11]、東莞(快代謝型、中間代謝型、慢代謝型分別為42.9%、44.5%、12.65%)基本相似[12]，而與汕頭地區(qū)(快代謝型、中間代謝型、慢代謝型分別為58.3%、33.3%、8.3%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[13]。汕頭地區(qū)的快代謝型人群比例高于佛山，而中間代謝型和慢代謝型人群比例低于佛山。

本研究是關(guān)于廣東佛山地區(qū)1 083例漢族冠心病患者CYP2C19基因多態(tài)性的研究。本研究得出的結(jié)論為臨床基于遺傳信息的合理用藥提供了很好的理論基礎(chǔ)。廣東佛山地區(qū)冠心病患者中有較多的CYP2C19代謝功能缺失基因，臨床用藥前應(yīng)加強(qiáng)患者基因檢測，調(diào)整用藥劑量或種類，實現(xiàn)精準(zhǔn)治療。