王 磊，孫文利，劉紅星

(河北燕達陸道培醫(yī)院，河北廊坊 065201)

泊沙康唑是新一代三唑類廣譜抗真菌藥物，是被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于預防侵襲性曲霉菌感染的一線藥物，可用于13歲以上嚴重免疫抑制患者侵襲性真菌感染和念珠菌感染的預防和治療[1]，還可用于無法耐受常用抗真菌藥物成人患者的侵襲性曲霉病、鐮刀菌病、慢性芽生菌病、分枝桿菌病和球孢子菌病的治療[2]。侵襲性曲霉菌感染是移植患者最危險的并發(fā)癥之一，病死率高，常推薦口服泊沙康唑預防感染。藥物低暴露量與泊沙康唑臨床療效不佳密切相關，藥物高暴露量則可增加藥物的毒性反應。美國傳染病學(IDSA)2007年更新的《組織胞漿病治療指南》也指出，由于個體間變異和潛在的藥物相互作用，測定穩(wěn)態(tài)血藥濃度有助于提高療效[3-4]。多數(shù)研究認為泊沙康唑血漿谷值與抗真菌療效最相關的藥動學/藥效學參數(shù)AUC24/MIC有較好的相關性[5-8]。因此，通過檢測泊沙康唑血漿谷值可以有效提高用藥的有效性與安全性，從而為臨床合理使用泊沙康唑提供參考。目前，關于國內(nèi)泊沙康唑血藥濃度監(jiān)測研究較少，可用于借鑒的方法更少，且檢測方法多為色譜法。色譜法分析時間長，前處理繁瑣，所需血樣量多，污染大，而質(zhì)譜法用于泊沙康唑血藥濃度的檢測耗時短，處理簡單。因此，開發(fā)一種適合泊沙康唑血藥濃度檢測的質(zhì)譜法用于臨床血藥濃度監(jiān)測，就顯得非常重要。本文作了這方面研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 島津20A高效液相色譜系統(tǒng)(帶自動進樣器)，配有AB Sciex 4000 QTRAP質(zhì)譜儀，其林貝爾渦旋混合器，全自動高速冷凍離心機(Thermo Fisher)，Analyst V1.5.2工作站(AB公司)。

1.2試劑 甲醇(HPLC-Grade，fisher)、屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏)、甲酸(色譜級，Mreda Technology INC)、乙酸銨(色譜級，Mreda Technology INC)、泊沙康唑及泊沙康唑-d4(Standard Refrence Material from qcc.USA)。

1.3方法

1.3.1高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法的液相色譜及質(zhì)譜條件 (1)色譜條件。采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×50.0 mm，5 μm)，柱溫50 ℃；進樣量3 μL；流動相A：0.1%甲酸的甲醇溶液；流動相B：2 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸的水溶液。流速：0.800 0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，其中0.1～0.2 min，A相水平75%～90%，保持0.2 min，>0.2～0.5 min A相水平75%～90%，保持0.3 min，>0.5～0.9 min A相水平75%，保持2.1 min。(2)質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離源(ESI)；離子極性：正離子模式；掃描方式為多重反應監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓(IS)：5 500.00；溫度：425.00 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)：55；氣體2(GS2，N2)：55；氣簾氣體(CUR，N2)：20；碰撞氣壓力：中等；用于定量分析的離子反應為泊沙康唑m/z 701.5～683.4、泊沙康唑-d4 m/z 705.4～687.5。各種質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜條件

1.3.2對照品貯備液的配制 精確稱取對照品泊沙康唑10.00 mg，置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1 mg/mL泊沙康唑母液，作為貯備液。然后分別用甲醇水(1∶1)依次稀釋母液，泊沙康唑?qū)φ掌匪椒謩e為1、5、10、25、50、75、100 μg/mL，作為系列標準工作液。

1.3.3樣品處理方法 精密量取標本血漿100 μL置于1.5 mL 離心管中，然后加入2 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液100 μL，渦旋振蕩1 min，再加入含有特定水平泊沙康唑-d4的甲醇800 μL，渦旋振蕩1 min，于13 000 r/min離心10 min，取上清液170 μL置于自動進樣器。

1.3.4標準曲線的制備 分別在7個1.5 mL 離心管中加入10 μL泊沙康唑各系列標準工作液，并加入空白血漿90 μL，得到泊沙康唑水平為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10 μg/mL系列質(zhì)量濃度。按“1.3”項中樣品處理方法處理后進樣測定，以泊沙康唑峰面積與泊沙康唑-d4峰面積比為(Y)對泊沙康唑水平(X)進行線性回歸，得泊沙康唑標準曲線。

1.3.5回收率、精密度試驗 分別在3個1.5 mL離心管中加入泊沙康唑標準工作液5、10、50 μg/mL各10 μL，并加入空白血漿90 μL，得到泊沙康唑水平為0.5、1.0、5.0 μg/mL的樣品。按“1.3”項中樣品處理方法處理后進樣測定，各水平日內(nèi)重復測定5次，計算相對回收率及日內(nèi)精密度，并連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。

1.3.6穩(wěn)定性試驗 分別在3個1.5 mL離心管中加入泊沙康唑標準工作液5、10、50 μg/mL各10 μL，并加入空白血漿90 μL，得到泊沙康唑水平為0.5、1.0、5.0 μg/mL的樣品。取1份樣品按“1.3”項中血樣處理方法處理后置于4 ℃冰箱中，于放置時間為72 h分別測定各樣品的水平；其余樣品于4 ℃冰箱中放置72 h后取出放至室溫，按“1.3”項中樣品處理方法處理后進樣測定，考察其穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1色譜質(zhì)譜行為 在“1.1”項下的色譜、質(zhì)譜條件下，測得泊沙康唑及泊沙康唑-d4質(zhì)譜圖，見圖1；泊沙康唑及泊沙康唑-d4的色譜圖，見圖2。由圖2可知，血中沒有物質(zhì)干擾泊沙康唑的測定，泊沙康唑的保留時間為2.93 min，峰型良好，無雜質(zhì)峰干擾。

圖1 泊沙康唑、泊沙康唑-d4質(zhì)譜圖

注：A為泊沙康唑；B為泊沙康唑-d4

圖2 泊沙康唑及泊沙康唑-d4色譜圖

2.2標準曲線回歸方程 泊沙康唑的回歸方程：Y=1.11×105X+2.78×103，r=0.993 0，表明泊沙康唑在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系較好，可用于定量檢測，其最低定量限為0.025 μg/mL。標準曲線見圖3。

圖3 泊沙康唑標準曲線

2.3方法學評價結(jié)果 泊沙康唑的相對回收率為90%～103%，日內(nèi)及日間精密度均小于5%。見表2。

表2 回收率和精密度試驗結(jié)果(n=5)

2.4穩(wěn)定性考察結(jié)果 由表3可知，在4 ℃條件下，血中泊沙康唑放置72 h水平無明顯下降；血樣經(jīng)過處理后，在4 ℃條件下，泊沙康唑放置72 h水平基本保持不變。由此可以得出，在此條件下測定血中泊沙康唑水平的穩(wěn)定性良好，能保證測定結(jié)果的準確性。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5臨床應用 收集2015年12月至2016年8月筆者所在醫(yī)院檢測泊沙康唑血藥濃度的患者血漿標本50份，其中男23份，女27份；患者年齡1～66歲。標本采集時間為下次給藥前，采集靜脈血2 mL，混勻，EDTA抗凝。室溫(20～25 ℃)下標本存放時間不超過4 h，當日檢測。藥物血藥濃度結(jié)果見表4。HPLC-MS/MS法能滿足臨床對泊沙康唑血藥濃度監(jiān)測的需求，同時也可以反映出泊沙康唑臨床應用血藥濃度一般不會太高，很少產(chǎn)生明顯毒性及嚴重不良反應；檢測中血藥濃度低值較多，達不到預防和治療真菌感染的效果。

表4 血藥濃度檢測結(jié)果(n=50)

3 討 論

泊沙康唑有明顯藥代動力學參數(shù)個體差異，口服泊沙康唑通過胃腸道吸收，但吸收具有飽和性。口服劑量小于800 mg時，其血藥濃度和劑量呈線性關系，達到或超過800 mg 時吸收程度開始顯著降低。泊沙康唑在體內(nèi)的分布很廣泛，口服給藥5～8 h后達峰值血藥濃度。泊沙康唑的血漿蛋白結(jié)合率很高(98.2%)，主要與清蛋白結(jié)合，所以一般血藥濃度檢測采用血漿。泊沙康唑幾乎不通過肝細胞色素(CYP)酶系代謝，一般通過葡萄糖醛酸化反應代謝，但它可以明顯抑制肝酶CYP3A4的活性，消除半衰期很長(超過35 h)，連續(xù)口服給藥后7～10 d達穩(wěn)態(tài)血藥濃度[9]。移植患者免疫功能弱，容易感染[9-11]。侵襲性曲霉菌感染是移植患者最危險的并發(fā)癥之一，病死率高，常推薦口服泊沙康唑預防該類患者的侵襲性曲霉菌感染[12]，建議其有效水平參考范圍是0.5～5.0 μg/mL。最近研究指出，泊沙康唑用于預防真菌感染時，其血藥濃度>0.70 μg/mL，最佳有效濃度靶值為1.25 μg/mL[2-9,13-16]。

本方案檢測采用紫色試管(EDTA)，需采集約2 mL全血，離心取上清液，通過甲醇沉淀蛋白和萃取泊沙康唑，使泊沙康唑充分溶解于甲醇中。通過島津LC-20A高效液相色譜進行分離和富集泊沙康唑，用AB Sciex 4000 QTRAP型質(zhì)譜儀進行監(jiān)測。同時，選用同位素泊沙康唑-d4作內(nèi)標，進行定量，結(jié)果線性良好，回收率高，日內(nèi)、日間精密度符合生物樣本的分析要求，適于臨床應用血藥濃度監(jiān)測。該處理方法簡單、易操作和重復性好，避免了批間和樣本間的系統(tǒng)誤差，用于泊沙康唑的母體藥物測定準確度高，特異性強[17-18]。