魏沙沙，邱小鳳，蔡雪玲，孫威江1,，陳志丹*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3．福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 泉州 362400；4.福建省茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)開發(fā)基地，福建 泉州 362400)

TCP轉(zhuǎn)錄因子家族在玉米TB1、金魚草CYC和水稻PCF中最早發(fā)現(xiàn)，取首字母(TB1-CYC-PCF)進(jìn)行縮寫，得到名稱TCP。TCP轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其特征是擁有一個由60個氨基酸組成的高度保守的TCP結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是一個非典型的bHLH(堿性-螺旋-環(huán)-螺旋)結(jié)構(gòu)域，廣泛參與了植物生長發(fā)育的特定階段連同部分生理生化反應(yīng)的過程，如參與調(diào)控葉、花型和側(cè)枝的生長發(fā)育，這些在擬南芥[1-3]、玉米[4]、水稻[5]、棉花[6-7]、蘋果[8]、黃瓜[9]、葡萄[10]、西瓜[11]、矮牽牛[12-13]等的研究中已被發(fā)現(xiàn)。在對TCP2、TCP3、TCP4、TCP11、TCP16、TCP24等的研究中發(fā)現(xiàn)，TCP家族的功能在各成員內(nèi)普遍存在著相似性[14-17]。根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域的序列特點(diǎn)，分成Class I和Class II兩個亞家族。又因TCP結(jié)構(gòu)域的差異，Class II可以被細(xì)分為CIN支和CYC/TB1分支[18]。相關(guān)研究顯示，TCP4基因在細(xì)胞分化環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要控制作用，表達(dá)變化將導(dǎo)致營養(yǎng)生長、生殖生長、細(xì)胞的增殖速度、育性、衰老速度以及葉片大小的變化[16]。TCP基因家族被證明能調(diào)控植物葉片大小和形狀[19]，但該轉(zhuǎn)錄因子在鐵觀音茶樹中的功能研究較少，本研究克隆得到鐵觀音茶樹CsTCP4基因，對其特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究確定鐵觀音茶樹CsTCP4基因?qū)τ诓铇淙~片的調(diào)控作用，為鐵觀音茶樹種質(zhì)資源研究利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植在福建農(nóng)林大學(xué)福州校區(qū)南區(qū)茶園的鐵觀音品種茶樹為樣品材料，采摘一芽一二葉鮮葉迅速用液氮固樣，置于-80℃冰箱貯藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒方法提取茶樹總RNA，參考Takara公司的SMARTer 5′/3′ Kit Component試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于RACE擴(kuò)增。

1.2.2 TCP4基因5′端的克隆 根據(jù)陳志丹的前期試驗[20]得出的已知片段TDP49，設(shè)計兩條3′RACE上游引物TDF49 3′-1和 TDF49 3′-2，以AP為逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，第一輪反應(yīng)引物用TDF49 3′-1和AUAP，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，以TDF49 3′-2和AUAP作為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。

1.2.3 TCP4基因3′端的克隆 對于TCP4基因5′端序列的擴(kuò)增，采用5′-RACE CDS Prime A進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，以UPM和TDF49 5′-1進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100位模板，以UPM和TDF49 5′-2為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵觀音茶樹總RNA的提取與檢測

從提取的鐵觀音茶樹RNA的電泳檢測圖譜(圖1)可知，RNA的28S和18S的條帶清晰，而28S rRNA的亮度和18S rRNA相比，亮了將近1倍，經(jīng)紫外分光光度計檢測結(jié)果(見表2)，OD260/OD280值在1.8～2.2之間，說明樣品中沒有蛋白質(zhì)和其它有機(jī)物的污染，且沒有水解為單核酸，OD260/OD230大于2，說明RNA樣品中沒有其它小分子物質(zhì)的干擾，因此可見提取的總RNA具有很好的完整性和很高的純度，可以滿足后續(xù)RACE擴(kuò)增需要。

表1 鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄因子TCP4克隆涉及引物信息

圖1 鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄因子TCP4的克隆

表2 鐵觀音茶樹總RNA濃度

2.2 鐵觀音茶樹TCP基因cDNA全長的克隆及序列分析

2.2.1 鐵觀音茶樹TCP基因的cDNA 3′RACE的克隆與序列分析 以AP為逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，利用兩條3′RACE的上游引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果表明該3′RACE的產(chǎn)物為845 bp，與預(yù)期大小相符，且與已知保守區(qū)片段有100bp的堿基重疊，所以可以確定所獲得的片段為鐵觀音茶樹TCP基因的3′RACE部分。

2.2.2 鐵觀音茶樹TCP基因的cDNA 5′RACE的克隆與序列分析 以5′RACE CDS Primes A反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果表明該5′RACE產(chǎn)物的片段長度為472bp，與預(yù)期大小相符，且與已知片段有108bp重疊堿基，所以可以確定此片段為鐵觀音茶樹TCP基因的5′RACE部分。

2.2.3 鐵觀音茶樹TCP基因cDNA全長序列分析 使用DNAman軟件將5′RACE、已知序列和3′RACE cDNA核苷酸序列進(jìn)行拼接，獲得TCP基因的基因全長序列為1264bp(圖3)，其中開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為795bp，編碼264個氨基酸，5′非編碼區(qū)為171bp，3′非編碼區(qū)為298bp，ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子。

2.3 鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄因子TCP4生物信息學(xué)分析

2.3.1 氨基酸序列的構(gòu)成成分和理化性質(zhì) 利用DNAman軟件對TCP氨基酸進(jìn)行基本信息分析，鐵觀音茶樹TCP4基因開放閱讀框為795bp，編碼264個氨基酸。使用Expasy網(wǎng)站對其氨基酸基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析可知，轉(zhuǎn)錄因子TCP的組成有氨基酸264個；理論等電點(diǎn)是7.01；相對分子量是29559.02kDa；負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)為30個；正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)為30個；不穩(wěn)定指數(shù)為58.57>40，屬于不穩(wěn)定蛋白；蛋白的親水性平均系數(shù)(GRAVY值)是-0.717<0，屬于親水性蛋白；分子式：C1287H2010N372O407S11，總原子數(shù)為4087，氨基酸組成中絲氨酸(Ser)含量最高，為11.7%，谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)占比均為7.6%，含量僅次于絲氨酸。

圖2 鐵觀音茶樹TCP基因的cDNA全長序列

2.3.2 鐵觀音茶樹TCP的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析 采用MEGA5.05軟件的NJ法，將鐵觀音茶樹TCP基因的氨基酸序列與已知的茶樹、草莓、桃樹等14種TCP基因的氨基酸序列進(jìn)行同源進(jìn)化樹分析(圖3)。結(jié)果表明，所克隆出的鐵觀音茶樹TCP蛋白與草莓、桃樹蛋白的一致性高達(dá)100%，在親緣關(guān)系上最接近。其次是亞麻薺，與胡桃、棗、葡萄等的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

圖3 鐵觀音茶樹TCP系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3.3 磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測分析 真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)能夠識別和修飾不同蛋白質(zhì)的不同位點(diǎn)，是生物體內(nèi)一種普遍的調(diào)節(jié)方式，主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基側(cè)鏈的羥基上，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)果表明，TCP基因含有多個磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸位點(diǎn)最多，其次是蘇氨酸位點(diǎn)，絡(luò)氨酸位點(diǎn)最少，只有1個。說明磷酸化和去磷酸化的調(diào)控作用很大程度上影響到鐵觀音茶樹TCP4轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活性，如表3，圖4所示。

表3 鐵觀音茶樹TCP4磷酸化位點(diǎn)推測

圖4 鐵觀音茶樹TCP4蛋白磷酸化位點(diǎn)推測圖

2.3.4 信號肽分析 利用在線網(wǎng)站SignalP對此序列進(jìn)行信號肽分析，根據(jù)meanS-score大于0.5則預(yù)測為分泌蛋白，存在信號肽，小于0.5則沒有信號肽，如圖5所示，可知茶樹轉(zhuǎn)錄因子TCP4不存在信號肽序列，屬于非分泌蛋白轉(zhuǎn)錄因子TCP蛋白。

圖5 鐵觀音茶樹TCP4蛋白信號肽分析

2.3.5 跨膜區(qū)域推測 通過TMpred對鐵觀音茶樹TCP基因進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，跨膜區(qū)域存在不同的兩類(圖6)。第一類是從外向內(nèi)的跨膜螺旋，一處跨膜區(qū)位于182～204位氨基酸之間，得分率是787(++)；第二處跨膜區(qū)在219～238氨基酸之間，得分率是121(++)，總得分是908。第二類是從內(nèi)向外的跨膜螺旋，僅存在一處跨膜，位于189～211位氨基酸之間，得分率是388。而TCP家族屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，與DNA結(jié)合在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，因此上述兩種現(xiàn)象都不予以采用，TCP蛋白沒有參與跨膜的可能。

2.3.6 蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析 SMART軟件分析結(jié)果表明該蛋白在25～160的位置具有一定的活性(圖7)。同時經(jīng)過Prosite軟件分析結(jié)果表明，該蛋白還具有TCP家族特征多肽序列：RKDRHSKVCTARGPKDRRVRLSAHTAIQFYDVQDRLGYGRPSEAIDWLMKEAKSAIDAL，位于27-85位置(圖8)。

3 討論

TCP家族成員在細(xì)胞的伸長調(diào)控、雌雄配子發(fā)育、種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育、葉片衰老、茉莉酸合成、光形態(tài)建成以及生物鐘調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要功能[5]，TCP家族被劃分為classI和classII兩個亞族，classI由相關(guān)度較高的蛋白組成，被稱為PCF亞家族(PCF1和PCF2)，主要是通過PCNA基因的啟動子對DNA生理生化產(chǎn)生影響[3]，對植物生長發(fā)育進(jìn)行正調(diào)控。classII對植物生長起到負(fù)調(diào)控作用，據(jù)其結(jié)構(gòu)域差異又被分成兩個分支，CIN和ECE(CYC/TB1)，CIN分支主要參與到植物葉片、子葉等邊緣器官的發(fā)育，變異會導(dǎo)致葉片不正常且邊緣褶皺[21-26]。

圖 6 鐵觀音茶樹TCP4蛋白跨膜區(qū)域分析

圖7 鐵觀音茶轉(zhuǎn)錄因子TCP基因編碼蛋白的功能構(gòu)域

圖8 鐵觀音茶樹TCP合成酶活性位點(diǎn)

根據(jù)本試驗的分析結(jié)果顯示，鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄因子CsTCP4屬于classII家族的CIN分支。Nath等人發(fā)現(xiàn)，CIN基因的突變會影響金魚草的葉片形態(tài)，認(rèn)為CIN基因會促進(jìn)葉緣生長停滯[27]。CIN型轉(zhuǎn)錄因子對葉片形態(tài)變化功能的作用在擬南芥、金魚草和番茄等已有研究，證明該基因能夠限制正在發(fā)育的葉原基邊源的細(xì)胞增殖[22]。其次在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，TCP4基因也是作為MicroRNA319a的靶基因參與到葉片的調(diào)控過程[3]。TCP4表達(dá)出現(xiàn)變化將導(dǎo)致營養(yǎng)生長、生殖生長、細(xì)胞的增殖速度、育性、衰老速度以及葉片大小的變化[16],有相關(guān)研究表明，TCP4基因表達(dá)若是向上調(diào)整，會引起植物花瓣變得狹小，花藥的生長發(fā)育缺乏。而且它能促使茉莉酸的合成，進(jìn)一步影響葉片的衰老過程。根據(jù)克隆出來的鐵觀音茶樹TCP4基因的cDNA全長序列，采用生物信息學(xué)方式進(jìn)行分析得出，它由264個氨基酸組成，分子量為29559.02kDa；等電點(diǎn)為7.01；屬于親水性蛋白；不穩(wěn)定蛋白；未含信號肽；磷酸化和去磷酸化的調(diào)控在很大程度上影響到TCP4轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活性基因；含有特殊固有的bHLH結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，得出CsTCP4基因與草莓和桃樹的TCP親緣關(guān)系比較近。綜上所述，推測出CsTCP4基因在鐵觀音茶樹的生長發(fā)育中主要調(diào)控葉片的的生長發(fā)育，尤其是對葉片形態(tài)方面起到一定的影響作用。在前期研究中，本研究試驗材料供體鐵觀音茶樹也顯示出茶樹生長樹型較直立、葉片生長較為旺盛、茶樹葉片呈現(xiàn)稍斜向上生長的性狀，基因熒光定量表達(dá)分析也顯示該基因在試驗茶樹樣品中表達(dá)量較高，因此推測該株鐵觀音茶樹的這些性狀可能與TCP4基因高表達(dá)的正向調(diào)控有關(guān)，后期試驗可以運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，研究CsTCP4 基因在鐵觀音茶樹不同時期和葉位的表達(dá)量，具體還需要進(jìn)一步開展基因功能驗證研究分析，從而利用科學(xué)手段來改變表達(dá)程度，調(diào)節(jié)葉片的生長發(fā)育，改良基因遺傳特性，調(diào)整生長模式，對培育出整體品質(zhì)更高的鐵觀音茶樹有指導(dǎo)意義。