王讓劍，楊 軍，孔祥瑞

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

香氣是揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量的綜合效應(yīng)，是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要因子之一。茶葉香氣物質(zhì)占茶葉干重的比例很小，但種類繁多。在眾多揮發(fā)性物質(zhì)中，揮發(fā)性萜類物質(zhì)是構(gòu)成茶葉花果香的重要來源之一，該類化合物還具有化感作用、防蟲抗病等生物學(xué)功能，是茶樹中一類重要的次生代謝物質(zhì)。本文對(duì)茶樹中萜類揮發(fā)性物質(zhì)研究進(jìn)展進(jìn)行歸納，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，以期為今后相關(guān)研究提供參考。

1 茶葉中揮發(fā)性萜類的生物學(xué)功能

萜類化合物是種類、數(shù)量最豐富的一類植物、微生物次生代謝產(chǎn)物。已發(fā)現(xiàn)的各種萜類物質(zhì)超過55000種[1]，其中倍半萜是最大的一類，達(dá)到7000種[2]。萜類均具有“異戊二烯”的基本結(jié)構(gòu)單元，除以萜烯的形式存在外，還以各種含氧衍生物的形式存在，包括醇、醛、酸、酯、酮等。根據(jù)分子中碳原子數(shù)目可將萜類分為半萜、單萜、倍半萜、二萜等，其中半萜、單萜和倍半萜屬于“低萜”，具有揮發(fā)性，二萜及以上的化合物屬于“高萜”，一般不具有揮發(fā)性(表1)。

茶葉中已分離鑒定的萜類有近百種，主要是揮發(fā)性的單萜和倍半萜[3]，這些揮發(fā)性萜類香味活性高、香氣閾值低，常具有宜人的花果香，是構(gòu)成茶葉香氣的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，常見揮發(fā)性萜類香型特征如表2。

表1 萜類化合物的分類

表2 揮發(fā)性萜類香型特征

萜類化合物具有化感作用，尤以單萜和倍半萜類活性最強(qiáng)[5]。萜類等具有化感活性的物質(zhì)向環(huán)境中釋放，能抑制或促進(jìn)自身及其鄰近植物的生長(zhǎng)發(fā)育，具體表現(xiàn)為排異作用或自毒作用。加州蒿和銀葉鼠尾草的葉中含有豐富的揮發(fā)性萜類物質(zhì)，可抑制其它草本植物種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，因而其灌叢植物的周圍可出現(xiàn)裸帶[6]。華北落葉松枝葉揮發(fā)物對(duì)自身種子表現(xiàn)出延遲萌發(fā)和抑制萌發(fā)的作用，20個(gè)揮發(fā)物中，單萜占5個(gè)，倍半萜占12個(gè)[7]。倍半萜內(nèi)酯類化合物可以促進(jìn)彎管列當(dāng)?shù)陌l(fā)芽和生長(zhǎng)，使紅豆下胚軸生長(zhǎng)減少40%[8]。

萜類化合物對(duì)植食性昆蟲具有直接或間接的防御作用。茶樹芽梢的揮發(fā)物是害蟲向茶樹定位的信息物質(zhì)，茶尺蠖、茶蚜、假眼小綠葉蟬對(duì)芳樟醇、香葉醇等揮發(fā)物具有較強(qiáng)的趨性，但單個(gè)化合物的引誘活性不如全組分芽梢揮發(fā)物[9]。天然茶樹芽梢釋放的揮發(fā)物對(duì)害蟲具引誘活性，但對(duì)天敵一般無引誘活性，但害蟲加害茶樹芽梢后誘導(dǎo)形成的新的揮發(fā)物(HIPVs)則對(duì)天敵具很強(qiáng)的引誘活性，而對(duì)害蟲一般沒有引誘活性[10-12]。α-法尼烯是蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物的主要成分之一，茶樹葉片受茶小綠葉蟬危害后會(huì)釋放出α-法尼烯，可顯著引誘葉蟬寄生性天敵纓小蜂[13,14]，α-法尼烯在一定濃度下還可對(duì)茶小綠葉蟬表現(xiàn)出排斥效應(yīng)[15]。此外，研究還表明包括芳樟醇在內(nèi)的揮發(fā)性混合物能引起茶尺蠖絨繭蜂最強(qiáng)的EAG反應(yīng)[16]，在低、高劑量下，門氏食蚜蠅對(duì)橙花醇分別有極顯著和顯著的趨性[17]。

萜類化合物還具有抑菌和殺菌作用。芳樟醇、香葉醇等萜類物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌及一些真菌具有一定的抑制作用[18]。在受茶餅病菌侵染的云南大葉種茶樹葉片中，萜類、含氮含硫化合物、芳香族化合物、綠葉性氣體為主要揮發(fā)物，萜類中芳樟醇是主要的揮發(fā)性物質(zhì)[19]。茶葉中游離態(tài)香氣組分及鍵合態(tài)糖苷類香氣前體均對(duì)茶云紋葉枯病致病菌具有不同程度的抑制作用，以香葉醇抑制作用最強(qiáng)[20]。此外，香葉醇在濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)對(duì)茶炭疽病菌的抑制率達(dá)到100%[21]。

2 茶葉中揮發(fā)性萜類的生物合成

2.1 揮發(fā)性萜類的生物合成

茶鮮葉中揮發(fā)性物質(zhì)的來源主要包括萜類的生物合成路徑、莽草酸代謝路徑以及脂肪酸代謝路徑，萜類揮發(fā)性物質(zhì)來自萜類的生物合成路徑(圖1)。

萜類的生物合成過程主要包括3個(gè)階段：異戊烯基二磷酸酯(IPP)及其雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)生成階段；香葉基二磷酸GPP(香葉基香葉基二磷酸GGPP)、法尼基二磷酸FPP生成階段；萜類生成及其修飾階段，包括氧化還原、?；⑻腔?。第1個(gè)階段中IPP及DMAPP有兩個(gè)合成途徑，即質(zhì)體中的MEP途徑和細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑。前兩個(gè)階段的合成過程已比較清晰，是所有的萜類化合物所共有的階段，第3個(gè)階段決定了萜類化合物結(jié)構(gòu)多樣性，是植物次生代謝研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[22]。

參與萜類生物合成途徑的酶也可分成3類。第1類是催化IPP及DMAPP合成的酶，如：3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)等。第2類是催化IPP及DMAPP形成各種中間體或萜類終產(chǎn)物的酶，如各種萜類合成酶等。第3類是對(duì)萜類終產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的酶，如甲基化、羥基化、?；?、糖基化等。合成途徑中的關(guān)鍵酶決定了下游萜類產(chǎn)物合成與積累的量，通過調(diào)控這些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平可以調(diào)節(jié)相關(guān)萜類物質(zhì)的產(chǎn)量[23]。迄今為止，已經(jīng)克隆了茶樹萜類物質(zhì)合成途徑中的3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、法尼基焦磷酸合成酶(FPS)、香葉基香葉基焦磷酸合成酶(GGPS)、芳樟醇合成酶(LIS)、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS)、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶(HDR)等基因[24,25]。

圖1 茶樹鮮葉中揮發(fā)性香氣物質(zhì)生物合成途徑

萜類合成酶是萜類化合物合成的關(guān)鍵酶。萜類合成酶結(jié)構(gòu)上的細(xì)微改變可以產(chǎn)生新的催化活性，能催化單一底物形成多種產(chǎn)物，是萜類化合物結(jié)構(gòu)多樣性的主因[26-28]。研究表明，倍半萜合成酶一般無信號(hào)肽，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而單萜和二萜合成酶有一段定位于質(zhì)體的信號(hào)肽，主要定位于質(zhì)體上[29]，也有研究表明單萜和二萜可在細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中生成[30]。目前為止，已在擬南芥、葡萄、煙草等40多種植物中克隆了200多個(gè)單萜和倍半萜合成酶基因[26]。茶葉中萜類合成酶研究近年來獲得了重要突破，茶樹芳樟醇/橙花叔醇合成酶基因(CsLIS/NES)可生成2個(gè)轉(zhuǎn)錄本：全長(zhǎng)CsLIS/NES-1與斷頭的CsLIS/NES-2，前者含定位于葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，后者則丟失該轉(zhuǎn)運(yùn)肽，兩者分別定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)，離體條件下，二者均可催化生成芳樟醇/橙花叔醇，但在機(jī)體內(nèi)CsLIS/NES-1僅催化芳樟醇的生物合成，而CsLIS/NES-2僅催化橙花叔醇的生物合成[31]。

2.2 揮發(fā)性萜類的合成調(diào)控

揮發(fā)性萜類的生物合成在很大程度上受到昆蟲或微生物誘導(dǎo)。研究表明茶小卷葉蛾[32]、茶麗紋象甲[33-34]、茶尺蠖[35]取食茶樹后，均能誘導(dǎo)茶樹釋放芳樟醇、α-法尼烯、橙花叔醇和羅勒烯等萜類揮發(fā)物。當(dāng)茶樹遭受病蟲害侵害時(shí)，葉片中一些萜類合成酶基因的表達(dá)明顯增強(qiáng)。茶尺蠖取食茶樹后，揮發(fā)性萜類生物合成途徑中共有9個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，分別包括MVA路徑中2個(gè)3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMGS)與2個(gè)3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)，MEP途徑中1個(gè)羥甲基丁烯二磷酸合成酶(HDS)及1個(gè)羥甲基丁烯二磷酸還原酶(HDR)，3個(gè)萜類合成酶(TPS)[36]。茶樹萜類合成MVA路徑中的1個(gè)HMGR能被茶尺蠖和小綠葉蟬顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步證明蟲害能誘導(dǎo)萜類生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的上調(diào)表達(dá)[37]。我們前期在研究茶麗紋象甲取食茶樹新梢后其基因表達(dá)譜變化時(shí)亦發(fā)現(xiàn)茶樹萜類合成途徑中的1個(gè)法尼醇脫氫酶基因表達(dá)顯著上調(diào)(未發(fā)表)。

紫外照射及激素誘導(dǎo)也能影響萜類物質(zhì)的生物合成。紫外條件下，茶樹HGMR、DXR、GGPS基因表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，F(xiàn)PS基因則先降后升，DXS表達(dá)總體下調(diào)，而Lins基因在處理6 h內(nèi)先升后降[24]。用茉莉酸甲酯、水楊酸、ABA等激素處理茶樹后發(fā)現(xiàn)HDS與HDR基因均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)[25]。用茉莉酸甲酯處理茶樹芽葉后，芳樟醇、香葉醇及苯乙醇含量明顯增加，則直接證明激素誘導(dǎo)能提高茶樹葉片中萜類物質(zhì)的生物合成量[38]。

3 茶葉中的揮發(fā)性萜類的存在方式

茶樹在自然狀態(tài)下釋放的萜類物質(zhì)主要來自花，在花蕾綻放初期，芳樟醇、香葉醇以及橙花醇等單萜類的含量明顯升高，吸引昆蟲授粉[39-40]。茶鮮葉中游離態(tài)的揮發(fā)性萜類化合物含量遠(yuǎn)低于鍵合態(tài)的萜類糖苷[41]，這也是茶鮮葉一般無香味的主要原因。在茶葉加工過程中，體內(nèi)積累的糖苷會(huì)在內(nèi)源糖苷酶的作用下水解，釋放出揮發(fā)性萜類苷元，從而表現(xiàn)出花果香特征。目前已經(jīng)從茶葉中分離鑒定了多種萜類糖苷，基本為二糖苷和單糖苷，其中二糖苷以β-櫻草糖苷為主，單糖苷以β-葡萄糖苷為主，且β-櫻草糖苷含量遠(yuǎn)高于β-葡萄糖苷[42-44]。

茶葉中的糖苷酶是參與糖苷水解的一類重要酶，以β-葡萄糖苷酶與β-櫻草糖苷酶的研究居多。β-葡萄糖苷酶水解β-D-糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基，而β-櫻草糖苷酶水解櫻草糖苷生成二糖和相應(yīng)的配基，但保留二糖內(nèi)部化學(xué)鍵。目前為止，有關(guān)茶葉中β-葡萄糖苷酶與β-櫻草糖苷酶的蛋白分離純化[45-46]、基因克隆表達(dá)[47-50]等研究已有較多的報(bào)道。

糖苷的存在，一方面可能是有利于其在體內(nèi)運(yùn)輸，另一方面可能是以一種低毒或脫毒的形式避免其苷元對(duì)植物自身造成毒害[51]。糖苷的形成與糖基轉(zhuǎn)移酶有著重要的聯(lián)系，該酶通常催化活化的尿苷二磷酸-D-葡萄糖向糖基受體轉(zhuǎn)移葡萄糖分子形成糖苷，幾乎存在于所有生命體中，大量的代謝過程均需要其參與[52]。糖基轉(zhuǎn)移酶是一個(gè)復(fù)雜的家族，不同植物中糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員數(shù)目不同，小立碗蘚含有17個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶家族1成員，而桉樹則含有377個(gè)家族1成員[53]。近年來隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量的糖基轉(zhuǎn)移酶基因被發(fā)現(xiàn)，但多數(shù)基因的功能均未進(jìn)行驗(yàn)證，模式植物擬南芥中進(jìn)行功能驗(yàn)證的糖基轉(zhuǎn)移酶基因不到其總數(shù)的20%[54]。值得一提的是，利用代謝組學(xué)方法聯(lián)合基因表達(dá)以及重組蛋白功能鑒定技術(shù)驗(yàn)證了第一個(gè)單萜糖苷糖基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能[55]，這為今后開展糖基轉(zhuǎn)移酶功能鑒定提供了參考。茶葉中糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)研究目前尚未見報(bào)道。

研究表明β-葡萄糖苷酶可以催化糖苷轉(zhuǎn)移反應(yīng)，形成新的糖苷化合物[56]。漳平水仙茶加工過程中晾青葉糖苷類香氣前體含量較鮮葉有顯著增加，搖青葉在做青過程中可能存在著糖苷酶解與合成的動(dòng)態(tài)平衡[57]，亦說明β-葡萄糖苷酶可能存在催化糖苷合成的生物學(xué)功能。

4 展望

揮發(fā)性萜類化合物是茶葉香氣的重要來源，且對(duì)茶葉病蟲害具有抑制作用，是茶葉中一類重要的次生代謝物質(zhì)，其在茶樹芽葉中主要以糖苷形式存在?；铙w狀態(tài)下，糖苷類與糖苷水解酶類是隔離的，當(dāng)茶樹葉芽經(jīng)歷病蟲害侵襲、損傷以及加工時(shí)，細(xì)胞破裂導(dǎo)致糖苷與糖苷水解酶充分接觸并在其作用下水解，釋放出揮發(fā)性的萜類化合物，從而表現(xiàn)出香味、抗病蟲等生命特征。

雖然萜類的生物合成途徑已基本清晰，但茶樹芽葉中的萜類多以糖苷的形式存在，其合成機(jī)制仍不明確，因此糖苷類在茶樹葉芽中是如何合成和累積的將成為今后茶葉香氣形成機(jī)理及茶樹病蟲害防治研究的重點(diǎn)之一。隨著茶樹基因組的破譯[58-59]以及功能基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等技術(shù)在茶學(xué)研究中的逐步應(yīng)用，茶樹芽葉中萜類糖苷生物合成途徑及其累積機(jī)理的充分解析必將得以實(shí)現(xiàn)。

烏龍茶最顯著的特征是具有自然優(yōu)雅的花果香，研究表明[60]適制烏龍茶品種糖苷類香氣前體含量較高，綠茶品種則較低，因此在高香型茶樹品種選育過程中宜加強(qiáng)篩選高糖苷含量的茶樹種質(zhì)資源。