向奕，劉碩謙，龔志華，陳棟，肖文軍

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茶樹紫芽中花青素形成相關(guān)基因差異表達分析

向奕，劉碩謙，龔志華*，陳棟，肖文軍

湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，茶學教育部重點實驗室，湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128

花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，作為一種強自由基清除劑，它具有抗炎，抗氧化，降血壓，降血糖等多種保健功能。紫芽茶樹作為一種高花青素含量的特異性茶樹資源，其研究與利用越來越受人們的關(guān)注。為了解茶樹紫芽中花青素形成的分子機理，本研究通過對湖南農(nóng)業(yè)大學自選紫芽品種9803與綠芽品種9806進行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學分析，篩選得到42條與花青素代謝相關(guān)的unigene，其中比對到參考基因組中的有34條，未在參考基因組中登錄的有8條。KEGG富集分析表明這42個基因被富集到5個代謝通路中，包括類黃酮合成途徑，木質(zhì)素合成途徑，黃酮和黃酮醇合成途徑，油菜素甾醇合成途徑，以及參與轉(zhuǎn)錄因子的編碼。通過熒光定量PCR驗證，差異基因熒光定量PCR變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠。本次試驗在轉(zhuǎn)錄組水平上篩選出了茶葉紫芽花青素代謝相關(guān)的差異基因，為進一步揭示茶葉紫芽產(chǎn)生的分子機理奠定了基礎(chǔ)。

茶樹；花青素；差異基因；轉(zhuǎn)錄組測序；生物信息學分析

茶樹[(L.) O. Kuntze]屬于山茶科（），山茶屬（），茶組（）植物，原產(chǎn)于我國云南為主的西南地區(qū)[1]。茶樹是多年生植物，受外界環(huán)境影響可產(chǎn)生階段性紫色芽葉，而特異性紫芽茶樹品種全年新梢芽葉均為紅色、紫色或紅紫色[2]。作為一種特色稀有的茶樹資源，紫芽茶具有較高的花青素含量。長期以來，紅紫色芽葉因其飲用品質(zhì)欠佳而被忽略，科學人員在選育茶樹品種和制定茶樹栽培技術(shù)措施時甚至把減少紫色芽葉作為目標之一[3]。但是隨著花青素的醫(yī)學保健功能逐漸被闡明，紫芽茶樹資源的創(chuàng)新利用研究也逐漸深入，特色紫芽茶樹品種的選育和高花青素茶葉產(chǎn)品的開發(fā)利用越來越受人們的關(guān)注[4]。

馬春雷等[5]利用基因芯片技術(shù)對茶葉紫芽與綠芽進行分析，篩選到43個與茶樹次生代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學進程相關(guān)的差異基因。利用RT-PCR和RACE技術(shù)分離得到2個茶樹轉(zhuǎn)錄因子（登錄號：HQ660373）和（登錄號：HQ660374）的基因全長，利用熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)遮陰處理能顯著降低茶葉中的花青素含量，并提高的表達。馬成英等[6]利用RT-PCR與RACE技術(shù)從茶樹葉片中克隆得到了1個編碼類黃酮-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，并且構(gòu)建了原核表達載體，使其在大腸桿菌中得到了高效表達。王文麗等[7]利用RT-PCR方法，從cDNA中克隆得到了茶樹中編碼類黃酮3′-羥化酶的基因，將其命名為。陳林波等[8]對“紫娟”茶樹芽、第2葉、開面葉、成熟葉4個時期的轉(zhuǎn)錄組進行測序以及生物信息學相關(guān)分析，為研究茶樹紫芽不同生長時期的差異基因表達奠定了基礎(chǔ)。Sun等[9]克隆了1個在茶葉紫芽中上調(diào)表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為，并且印證了是通過形成MBW轉(zhuǎn)錄復合物調(diào)控茶葉花青素結(jié)構(gòu)基因的表達。

茶葉花青素代謝途徑的研究起步較晚，相比于模式植物而言還不夠成熟。上述研究對茶葉花青素代謝進行了初步的探討，部分參與花青素合成的基因已被克隆驗證，但是茶葉花青素代謝途徑是一個復雜的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，受到多個代謝途徑的共同影響，由一系列的酶催化完成。

因此，為進一步揭示花青素合成的遺傳機制，本試驗研究選取特異性紫芽品種9803作為試驗材料，其新梢芽葉全年均表現(xiàn)為紫色，作為一種特色稀有的茶樹資源，與普通綠芽品種相比，紫芽品種9803具有更高的花青素含量，是研究花青素形成機理的天然材料。對紫芽品種9803與綠芽品種9806進行轉(zhuǎn)錄組測序，在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上對差異表達基因進行篩選，并對差異基因進行GO（Gene Ontology）富集分析與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，篩選鑒定出茶葉紫芽花青素合成途徑相關(guān)基因，并對其進行功能注釋，為今后進行茶葉花青素代謝相關(guān)基因的克隆及功能驗證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用湖南農(nóng)業(yè)大學長安茶葉基地自選紫芽品種9803與綠芽品種9806（圖1）作為試驗材料。9803與9806由安化云臺山群體品種中自然選育而得，具有相似的遺傳背景。選取顏色一致，長勢良好，無機械損傷與病蟲災害的一芽一葉作為試驗原料，紫芽與綠芽品種各設(shè)置3個生物學重復。錫箔紙包好，液氮就地固樣，–80℃超低溫冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序與熒光定量PCR驗證。

圖1 實驗材料

1.2 花青素含量的測定

花青素含量測定參照陳虎等[10]方法。以0.1?mol·L-1的鹽酸乙醇溶液做參比液，用分光光度計測定提取液在530、620、650?nm波長下的吸光值。

花青素光密度值：ODλ=(OD530-OD620)-0.1×(OD650-OD620)

花青素含量/nmol·g-1=ODλ/ε×/×106

ODλ：花青素在530?nm波長下的光密度，ε：花青素摩爾消光系數(shù)4.62×104，：提取液總體積（mL），：取樣質(zhì)量（g），106：計算結(jié)果換算成nmol的倍數(shù)。

1.3 RNA提取

使用Tri-Reagent（Invitrogen，Burlington，ON，Canada）提取茶葉中的總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，超微量分光光度計（Nanodrop 2000C）和生物分析儀（Agilent 2100）分別檢測RNA的濃度及完整性。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

以檢測合格后的RNA構(gòu)建文庫，利用Illumina HiSeqTM2000測序平臺對庫檢合格的文庫進行雙端測序獲得原始測序數(shù)據(jù)。文庫的構(gòu)建及測序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理

對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾，去除掉帶接頭及低質(zhì)量的reads后，得到clean reads。以Xia等[11]完成的茶樹云抗10號基因組作為參考基因組，將clean reads與其進行序列比對；用HTSeq軟件對各樣品基因表達水平進行統(tǒng)計，基因的表達量用FPKM表示[12]；用R語言進行皮爾森相關(guān)系數(shù)的計算，以皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方（2）檢驗樣本選擇的合理性[13]；用DESeq對基因進行差異表達分析，對差異基因的顯著性值進行統(tǒng)計，用多重假設(shè)檢驗的方法對值進行校正以控制假陽性率，以校正后的值（adj）<0.05作為差異基因的篩選標準[14]；繪制基因差異表達火山圖，對差異基因的篩選結(jié)果進行直觀表示。

1.6 差異基因富集分析

運用GO數(shù)據(jù)庫對差異基因進行功能分類，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因代謝通路進行分析。

1.7 熒光定量PCR驗證

表1 熒光定量PCR引物序列

Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析與差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素含量

對紫芽品種9803與綠芽品種9806的花青素含量進行了測定，結(jié)果顯示紫芽中的花青素含量為(852.82±106.26)?nmol·g-1，綠芽中的花青素含量為(90.73±3.60)?nmol·g-1。紫芽中的花青素含量約為綠芽中的10倍，差異顯著。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量

本次試驗構(gòu)建紫芽品種9803和綠芽品種9806共6個轉(zhuǎn)錄組文庫。去除掉帶接頭及低質(zhì)量的reads后共獲得42.83?Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。由表2可知，Q30（堿基測序的正確率在99.9%以上的概率）占整個reads長度的94%以上，GC含量占43.9%，與參考基因組的比對率均在80%以上，測序情況良好，符合后續(xù)分析要求。

注：**：P＜0.01。Notes: **: P＜0.01.

表2 測序數(shù)據(jù)總體情況

注：CS_G：綠芽品種9806，CS_P：紫芽品種9803，1、2、3：為3組生物學重復。

Note: CS_G: Green variety 9806, CS_P: Purple variety 9803. 1, 2, 3: three biological replicates.

2.3 差異基因的篩選

2（皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方）是檢驗試驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。2越接近1，說明樣品的相關(guān)性越強。由表3可知，綠芽品種與紫芽品種之間2大于0.8，生物學重復樣品之間2均大于0.95，組內(nèi)＞組間。綜上所述，樣本選擇合理，試驗的重復性與可靠性都很高。

以校正后的值（adj）<0.05作為差異基因的篩選標準。為了更加直觀地看出差異基因的篩選結(jié)果，用火山圖顯示差異基因的整體分布情況。在圖3中，與綠芽品種相比，紫芽品種中有5?289個基因上調(diào)，5?771個基因下調(diào)，橫坐標為基因在兩個樣本之間表達差異的倍數(shù)變化，縱坐標代表基因表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性，越靠近上邊的點表達差異越顯著，越靠近左邊與右邊的點表達差異越顯著。

2.4 差異基因GO富集分析

對差異基因進行GO富集進行分析，共富集出3?835個GO分類，挑選出富集最顯著的30個GO分類用富集柱狀圖進行展示（圖4），直觀地反映了生物過程、細胞組分和分子功能中富集的GO分類上差異基因的個數(shù)分布情況。

這30個GO分類中，被富集到生物過程中的有22個，被富集到細胞組成中的有8個。其中小分子代謝過程（Small molecule metabolic process，GO: 0044281）和分子內(nèi)氧化還原酶活性（Intramolecular oxidoreductase activity，GO: 0016860）可能包含花青素代謝相關(guān)基因。在小分子代謝過程中包含421個差異基因，其中193個上調(diào)，228個下調(diào)；分子內(nèi)氧化還原酶活性中包含22個差異基因，其中14個上調(diào)，8個下調(diào)。

表3 樣品間的皮爾森相關(guān)系數(shù)

注：CS_G：綠芽品種9806，CS_P：紫芽品種9803，1、2、3為3組生物學重復。

Note: CS_G: Green variety 9806, CS_P: Purple variety 9803. 1, 2, 3: three biological replicates.

注：差異表達火山圖中的每1個點表示1個基因。紅色點代表顯著上調(diào)的基因，共5?289個；綠色點代表顯著下調(diào)的基因，共5?771個；藍色的點代表無顯著性差異表達的基因。

圖4 30個最顯著的GO分類

2.5 差異基因KEGG富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫，對茶葉紫芽形成過程中的代謝途徑（Pathway）進行富集分析，篩選出4條與花青素生物合成相關(guān)的代謝途徑，包括類黃酮生物合成途徑（Flavonoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇生物合成途徑（Flavone and flavonol biosynthesis）、苯丙素生物合成途徑（Phenylpropanoid biosynthesis）、花青素生物合成徑（Anthocyanin biosynthesis）。

對上述4條途徑中具有顯著差異的基因進行KEGG功能注釋及SwissProt數(shù)據(jù)庫比對，篩選到與花青素代謝相關(guān)的19種酶，統(tǒng)計顯示控制這些酶的基因共有42個（表4），其中比對到參考基因組中的有34個，未在參考基因組中登錄的有8個。

2.6 熒光定量PCR分析差異基因表達水平

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，在篩選出的花青素代謝相關(guān)的42個基因中，每一種酶隨機選擇1個基因，共19個基因進行熒光定量PCR驗證（圖5）。結(jié)果顯示，被測基因熒光定量PCR變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠。

3 討論

花青素代謝途徑屬于植物次生代謝途徑中的類黃酮合成途徑[15]。周瓊瓊等[16]通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，茶樹中9個類黃酮生物合成關(guān)鍵酶基因和在幼嫩紫葉中均為上調(diào)表達。本次研究篩選出24個參與類黃酮合成途徑的基因，除外，這些基因均在紫芽中上調(diào)表達且集中在類黃酮合成途徑的下游，屬于花青素合成途徑上游的等基因并未發(fā)現(xiàn)明顯表達差異，推測茶葉紫芽品種9803花青素合成主要由類黃酮合成途徑的下游進行調(diào)控。

表4 茶葉紫芽中花青素合成相關(guān)基因

注：通過熒光定量PCR驗證差異表達基因，選擇13個在9803中高表達與6個在9803中低表達的基因用于熒光定量PCR驗證，每個基因的相對表達水平用熒光定量PCR數(shù)據(jù)（黑色條）和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（白色條）之間的倍數(shù)變化表示，用β-actin作為內(nèi)參基因，星號表明基因表達量在9803和9806之間差異顯著，*：P<0.05，**：P<0.01。

周天山等[17]以湄潭苔茶后代的紫色芽葉茶樹為材料，發(fā)現(xiàn)基因在紫色芽葉中的表達量顯著高于綠葉。在本次研究中，在紫芽中的表達量顯著高于綠芽，但在紫芽中的表達量卻低于綠芽。范晶等[18]的研究表明能夠決定花青素B環(huán)羥基化的類型進而決定花青素的顏色?？梢源呋ㄇ嗨谺環(huán)3、5位置羥基化最終形成紫色的飛燕草素，則催化花青素B環(huán)3位置羥基化最終形成紫紅色的矢車菊素。紫芽品種9803中的上調(diào)表達及的下調(diào)表達使花青素更多地轉(zhuǎn)化為紫色的飛燕草素，這可能是紫芽品種9803主要表現(xiàn)為紫色，而湄潭苔茶后代的紫色芽葉品種則表現(xiàn)為紫紅色的原因。

經(jīng)過類黃酮途徑合成的花青素并不穩(wěn)定，需經(jīng)過糖基化修飾過程，才能形成具有相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的花色苷[19-20]。催化花青素C3位的糖基化形成花青素3--葡萄糖苷（單糖花色苷），是花青素最常見的糖基化修飾方式。王曉帆等[21]成功克隆了茶樹類黃酮3--葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，通過熒光定量PCR分析表明，該基因在葉片中的表達量較高，根莖中表達量較低。本次研究中未發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的基因，但是調(diào)控花青素3--葡萄糖苷5-位置糖基化的基因，及調(diào)控花青素3--葡萄糖苷2′′-位置葡萄糖醛酸基化的基因在紫芽品種9803中上調(diào)極為顯著。Nakatsuka等[22]發(fā)現(xiàn)藍色龍膽中基因可以使花青素形成雙糖花色苷，相比于形成的單糖花色苷更為穩(wěn)定。Sawada等[23]發(fā)現(xiàn)紅色雛菊中基因可以催化花青素形成花青素3--葡萄糖苷2′′--葡萄糖醛酸，其相比于花青素3--葡萄糖苷更易溶于水，從而促使花色苷在液泡中積累。這說明茶葉中除了外，可能還存在其他的花青素糖基化修飾方式，對完善茶葉花青素代謝途徑具有重要意義。

目前，茶葉花青素代謝的分子機理研究主要集中在類黃酮合成途徑的結(jié)構(gòu)基因及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子上[25, 26]，其他代謝途徑對花青素代謝的影響則少有報道。杜靈娟等[24]通過葡萄風信子基因與花色性狀之間的關(guān)聯(lián)性分析證實了基因與存在同一底物（二氫黃酮醇）的競爭，基因的表達影響黃酮醇合成，同時也影響著花青素含量的積累和花色的呈現(xiàn)。本次研究中在紫芽中表達量下調(diào)，使二氫黃酮醇更多地向花青素代謝途徑轉(zhuǎn)化，有助于花青素的累積。

同樣木質(zhì)素合成途徑與花青素合成途徑也存在底物競爭機制[25-26]，4-香豆酰-輔酶A不但是花青素合成途徑的底物，也是木質(zhì)素合成途徑的底物，與作為木質(zhì)素合成途徑初期的2個關(guān)鍵酶，在紫芽中的下調(diào)表達促使了4-香豆酰-輔酶A更多地向花青素途徑轉(zhuǎn)化，有利于花青素的積累。

油菜素甾醇作為近幾十年來新確認的植物激素，被稱為繼生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯之后的第6大類植物激素[27-28]。Peng等[29]研究表明，在擬南芥中油菜素甾醇可以通過調(diào)控花青素代謝途徑下游基因的生物合成從而促進花青素的積累。本次研究發(fā)現(xiàn)8條參與油菜素甾醇代謝途徑的基因，且這8個基因均在紫芽中上調(diào)表達，與Peng等[29]的研究結(jié)果一致。這些基因的上調(diào)表達促進了油菜素甾醇的合成，從而對花青素代謝途徑下游的基因進行調(diào)控，這可能是紫芽中類黃酮合成途徑下游基因表達量高的原因之一，與茶葉紫芽花青素合成主要由類黃酮合成途徑的下游進行調(diào)控的猜想相符。

植物花青素合成途徑受到MYB-bHLH- WD40轉(zhuǎn)錄復合體調(diào)控[30-31]，在本次研究中，發(fā)現(xiàn)了2個MYB轉(zhuǎn)錄因子、1個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在紫芽中顯著上調(diào)表達，未發(fā)現(xiàn)有顯著差異的WD40轉(zhuǎn)錄因子，三者可作為調(diào)控茶葉紫芽花青素合成的候選基因，其具體調(diào)控機制有待進一步驗證。

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Differential Expression Analysis of Genes Related to Anthocyanin Biosynthesis in Purple Buds of Tea Plant ()

XIANG Yi, LIU Shuoqian, GONG Zhihua*, CHEN Dong, XIAO Wenjun

College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China

Anthocyanins are water-soluble pigments which widely exist in plants. As strong free radical scavengers, they have many health benefical functions from anti-inflammatory, anti-oxidation, blood pressure lowering to hypoglycemic effect. The purple tea plants are a kind of specific tea germplasm rich in anthocyanins. More and more attentions had been focused on research and utilization of purple tea plants. In order to understand the molecular mechanism of anthocyanin biosynthesis in purple buds of tea, RNA-seq and bioinformatic analysis were performed using purple-buds cultivar 9803 and green-buds cultivar 9806 bred by Hunan Agricultural University, Changsha, China. Totally 42 unigenes were identified to be involved in anthocyanin biosynthetic pathway, including 34 genes registered in the GenBank database and 8 genes not reported. KEGG pathway analysis showed that differentially expression genes annotated to five metabolic pathways, including flavonoid biosynthetic pathway, lignin biosynthesis pathway, flavone and flavonol biosynthesis pathway, brassinosteroid biosynthesis pathway and encodingtranscription factors. The expression profiles of differentially expressed genes by qRT-PCR were consistent with transcriptome sequencing results, demonstrating the sequencing results were reliable. In summary, many differentially expressed genes related to anthocyanin biosynthesis in the purple buds of tea were identified, which laid the foundation for further investigation of the molecular mechanism of purple bud formation in tea plants.

tea plant, anthocyanin, differentially expressed genes, transcriptome sequencing, bioinformatics analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)05-439-11

2018-02-05

2018-04-01

國家自然科學基金（31670689）

向奕，男，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種及分子生物學研究。

gzh041211@163.com