高喜霞,程 妮, 2,曹毛毛,趙浩安,劉彩云,曹 煒, 2

(1.西北大學 化工學院, 陜西 西安 710069;2.陜西省蜂產品工程技術研究中心,陜西 西安 710065)

楊樹芽是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)植物中尚未充分發(fā)育和伸長的枝條或花,是自然界中廣泛存在的一種膠源物質,也是生物活性化合物的來源之一[1-2]。大量研究表明,楊樹芽是楊樹型蜂膠的主要植物源[3-4],楊樹型蜂膠具有抗菌、抗炎和細胞抑制等性質[5]。已有研究表明,楊樹芽提取物富含多酚類物質[6-7],包括類黃酮[8]、酚酸及其酯類化合物[9]。楊樹芽一直作為民間藥用于治療皮炎,上呼吸道感染和風濕類疾病[10-11]。現(xiàn)代藥理學研究表明,楊樹芽具有調節(jié)免疫、保護肝臟、抗炎和抗菌等生物活性[12-14]。由此可見,楊樹芽的研究具有重要的開發(fā)利用價值。

本文基于單因素實驗,以提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)為自變量,楊樹芽總黃酮提取率為響應值,利用響應面實驗設計方法,對楊樹芽總黃酮提取工藝進行優(yōu)化,同時考察楊樹芽總黃酮提取物的抗氧化活性。旨為楊樹芽資源的高值化開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊樹芽 陜西省佳縣;蘆丁(AR) Aladdin(上海生化股份有限公司);乙醇、苯、甲醇(國產分析純，新萬達科教儀器廠);正常熔點瓊脂糖(微克生物有限公司);1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 得研實驗生物試劑耗材;pBR322DNA 生工生物工程股份有限公司;HCL(AR，渤海集團化工有限公司);Trolox、菲洛嗪(AR) SIGMA-ALDRICH公司。

1.2 儀器與設備

HH-2J恒溫水浴鍋 萊悅納格儀器制造廠;101-00A型鼓風干燥箱 鼎昌儀器;RE52CS旋轉蒸發(fā)儀 亞榮生化儀器;SHZ-III循環(huán)水式真空泵 玖藍科學儀器;060ST超聲波清洗器 潔盟電器;722可見分光光度計 力辰實驗儀器;UVP Gelstudio touch凝膠成像儀 德國耶拿分析儀器股份公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 楊樹芽總黃酮的提取方法 楊樹芽經自然光晾曬至干,用粉碎機粉碎成末狀并經過250μm的篩子,得到楊樹芽粉末。將楊樹芽粉末與一定濃度的乙醇溶劑按比例混合,置于固定在水浴鍋上的圓底燒瓶中,通過熱回流的方式,同時設置溫度和時間進行提取。將所得提取液通過抽濾的方式得到其上清液并進行旋轉蒸發(fā)濃縮,對濃縮液進行冷凍干燥,即為楊樹芽提取物,儲藏于-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 楊樹芽中總黃酮的測定方法 楊樹芽提取物中總黃酮的測定參考孫麗萍等人的方法[15]。楊樹芽總黃酮的含量以蘆丁計。稱取0.5 g楊樹芽,用乙醇溶解并補充體積至25.0 mL,混勻后超聲提取0.5 h,取1.0 mL上清液置于蒸發(fā)皿中,并加入1 g聚酰胺粉,于40℃水浴下?lián)]掉乙醇,并移至層析柱,先用20.0 mL苯洗脫,以脫除實驗過程中的雜質,后用甲醇洗脫,收集甲醇溶液并定容至25 mL,于360 nm處測定吸光度。楊樹芽總黃酮含量按公式(1)計算,提取率按公式(2)計算。

(1)

式中:X為楊樹芽提取物中的總黃酮含量,單位mg/100g;A為由標曲算得被測液黃酮量,單位μg;M為楊樹芽活性成分提取物質量,單位g;V1為測定用試樣體積,單位mL;V2為試樣定容總體積,單位mL。

(2)

式中：Z為提取物中總黃酮的質量,單位g;Y為楊樹芽質量,單位g。

1.3.3 楊樹芽總黃酮提取工藝優(yōu)化

1)單因素實驗

分別考察料液比、提取時間、乙醇體積分數(shù)對楊樹芽提取物總黃酮提取率的影響。因素水平見表1。

表1 單因素實驗因素及水平Tab.1 Factors and levels used in single factor analysis

2) 響應面優(yōu)化實驗設計

基于單因素實驗,選擇提取時間X1、料液比X2和乙醇體積分數(shù)X3為自變量,以楊樹芽提取物中總黃酮提取率為響應值,對楊樹芽提取工藝進行響應面優(yōu)化。具體的因素水平見表2。

表2 響應面實驗因素及水平Tab.2 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.4 楊樹芽提取物體外抗氧化活性的測定方法

1)DPPH·清除活性

測定方法參考Zhao等人的方法[16-17]。移取1 mL楊樹芽提取物配置的濃度不同的楊樹芽提取液于試管中,各加入5 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液,室溫避光反應1 h,以甲醇為空白,以Vc為陽性對照,于517 nm處測定吸光度。DPPH·清除率按下式計算。

式中:A樣品為樣品的吸光度;A空白為空白的吸光度。

2)Fe3+還原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)的測定方法

參考ZHANG X等人的方法[18]。將0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH=3.6),0.01 mol/L TPTZ溶液(0.4 mol/L HCl)和0.02 mol/L氯化鐵溶液以體積比10∶1∶1的比例配成FRAP試劑,37 ℃保存?zhèn)溆?。移?.76 mL一定濃度的楊樹芽提取物配置的楊樹芽提取液于試管中,加入7.24 mL FRAP試劑使總體積為8 mL,常溫狀態(tài)下反應15 min,以Trolox為陽性對照,于593 nm處測吸光度。

3)Fe2+絡合力的測定方法

測定方法參考Rajapakse等人的方法[19]。準確吸取經適當稀釋的楊樹芽提取物配置的楊樹芽提取液200 μL,置于小離心管中,依次加入0.1 mL 1 mmol/L的FeSO4溶液,0.3 mL濃度為1 mmol/L的菲洛嗪(Ferrozine),并用甲醇補充體積至3 mL,反應0.17 h,以乙二胺四乙酸二鈉為標準,于562 nm處測其吸光度。

4)楊樹芽提取物對OH·介導的DNA鏈氧化損傷的保護作用

采用本實驗室建立的方法。實驗組加入0.5 μg pBR322質粒DNA，1 μL 1.0 mmol/LFeSO4，l μL 1%(體積分數(shù))H2O2和4 μL濃度不同的楊樹芽樣品溶液(1，5，15 μg/mL),并用50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.0)補充體積至15 μL;模型組不加楊樹芽樣品溶液;正常組不加誘導劑FeSO4、H2O2和楊樹芽樣液。待體系混勻后在37℃溫浴反應30 min；然后加入Loading buffer;再將0.8%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠熱熔后向其中加入Golden ViewR,乘熱倒膠,凝固后點樣,即可開始電泳。電泳時間為90min,電泳所需電壓為50V,電泳方向從負極到正極。結果用呈像儀拍照,Quantity One軟件分析電泳條帶,定量分析雙螺旋結構剩余含量,以評價楊樹芽提取物對OH·誘導的DNA氧化損傷的抑制作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6，Origin8.0及Quantity One軟件進行處理,實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 楊樹芽總黃酮的提取結果

2.1.1 提取時間對總黃酮提取率的影響 固定料液比(1∶10，g/mL)及乙醇濃度(75%，體積分數(shù)),本文研究了提取時間對楊樹芽總黃酮提取率的影響,結果見圖1。由圖1可知,在一定范圍內,楊樹芽總黃酮提取率與時間的延長呈正相關,2.0 h時達到最高。原因可能在于熱回流提取過程中,楊樹芽粉末中的黃酮類化合物濃度高于乙醇中的黃酮類化合物濃度,形成一定濃度梯度,致使其提取率在時間小于2.0 h時增幅較大,另一方面,熱回流提取過程中,物質與條件之間的相互作用加速了分子之間的運動,導致楊樹芽細胞壁破損,從而加速楊樹芽中活性成分的析出。當提取時間大于2.0 h時,提取率受提取時間的影響較小。這可能是隨著時間的延長,部分黃酮類化合物的析出已達極限,形成穩(wěn)定狀態(tài)。綜上所述,選擇2.0 h為楊樹芽的最優(yōu)提取時間。

圖1 提取時間對楊樹芽總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids from poplar buds

2.1.2 料液比對總黃酮提取率的影響 固定提取時間(1.5h)和乙醇濃度(75%，體積分數(shù)),本文考察了料液比對楊樹芽總黃酮提取率的影響,結果見圖2。由圖2可知,在一定范圍內,提取率與料液比的增加呈正相關,料液比為1∶15時,提取率達到最高?？赡苁侨軇w積不斷增加過程中,溶劑傳質動力增大,傳質效率增大,使得楊樹芽總黃酮提取率增大[20]。但是，料液比繼續(xù)增加后其提取率變化趨勢平穩(wěn)。這可能是溶劑體積的增加致使傳質擴散達到一種飽和穩(wěn)定狀態(tài)。鑒于過高的料液比會使實驗過程中回收困難,損耗增加,綜合考慮,本研究選取1∶15為最優(yōu)料液比[21]。

圖2 料液比對楊樹芽總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from poplar buds

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 固定料液比(1∶10，g/mL)和提取時間(1.5h),本文考察了乙醇濃度對楊樹芽總黃酮提取率的影響。結果如圖3所示,隨著乙醇濃度的增加,提取率呈遞增趨勢。當乙醇濃度大于85%時,提取率增幅較小。這可能與楊樹芽中黃酮類化合物的劑性有關。已有研究表明,楊樹芽富含黃酮類物質[22],其中一些平面性強的分子,因分子間排列緊湊,引力較大,故難溶于水,易溶于有機溶劑?？紤]到乙醇濃度過高會使楊樹芽中的一些極性較小的物質如脂溶性色素等容易溶出[21],因而采用體積分數(shù)為85%的乙醇提取楊樹芽中的黃酮類化合物比較適宜。

圖3 不同濃度乙醇對楊樹芽總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of ethanol on the extraction rate of total flavonoids from poplar buds

2.2 楊樹芽總黃酮提取的工藝優(yōu)化結果

2.2.1 響應模型的建立與分析 響應面分析法是將一個體系的響應作為一個或多個因素的函數(shù),通過圖形的方式將此函數(shù)關系顯現(xiàn),以方便實驗人員選擇試驗設計中的最優(yōu)條件。響應面試驗設計及結果見表3。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到該模型方差分析結果,見表4。對表4的數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到如下回歸方程:Y=-224.15+16.14X1+603.98X2+4.51X3-62.40X1X2-0.032X1X3-2.67X2X3-2.09X12-1899.20X22-0.024X32。

從表4方差分析可以看出,該模型回歸極顯著(P<0.000 1),失擬項不顯著(P=0.148 8>0.05),說明該模型符合標準;R2為0.989 9,說明楊樹芽總黃酮提取率的實際實驗值與理想預測實驗值之間有較好的擬合度。該模型可用于推測提取率的實際情況。

表3 響應面實驗設計及結果Tab.3 Experimental design and results for RSM

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression model

注:P<0.05,差異顯著;P<0.01,差異極顯著。

從表4回歸系數(shù)檢驗結果可知,在回歸方程的一次項中,X2和X3差異極顯著(P<0.01),表明其對該模型的響應值有極大影響,X1差異顯著(0.01X2>X1,即乙醇濃度>料液比>提取時間。交互項X1X2和X2X3差異極顯著(P<0.01),二次項差異均極顯著(P<0.01)。

2.2.2 響應面分析結果 響應面圖形中的曲面斜率越大,考察因素對響應值影響越大;等高線圖形中的曲線越向中心靠攏,即形狀越相似于橢圓形,交互作用越顯著,否則則表示交互作用不顯著[23]。由圖4可知,提取時間與料液比的響應面曲面斜率較大,等高線圖形呈橢圓形,說明其對提取率的交互作用影響極顯著(P<0.01),且從響應面曲面斜率大小可知,料液比對提取率的影響更大;料液比與乙醇體積分數(shù)的曲面斜率較大,等高線圖形呈橢圓形,說明其對提取率影響的交互作用極顯著(P<0.01),且從響應面曲面斜率大小可知,乙醇濃度影響作用大于料液比;與方差分析結果相符。

圖4 各因素間交互作用對楊樹芽總黃酮提取率影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots showing the effect of interactions among various factors on the total flavonoid extraction rate of poplar bud

2.2.3 最優(yōu)提取工藝驗證 通過響應面軟件的數(shù)據(jù)分析,得出最佳工藝條件為:提取時間2.16 h、料液比1∶16.31 (g/mL)、乙醇體積分數(shù)86.26%,楊樹芽總黃酮提取率的預測值為13.00%。為了驗證該模型的可靠性,對得到的工藝條件進行實驗驗證,考慮到各方面條件,將其調整為:提取時間2 h、料液比1∶16 (g/mL)、乙醇濃度85%,該條件下實驗3次,得到楊樹芽總黃酮提取率均值為13.14%,接近預測值,這說明優(yōu)化得到的楊樹芽提取工藝條件可靠,預測性好,合理可行。

2.3 楊樹芽總黃酮的體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH·清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基,色澤透亮呈深紫色[24],自由基清除劑可與DPPH·生成穩(wěn)定的黃色化合物,體系色澤度與抗氧化劑的供氫能力有關[25-27]。DPPH·清除率與抗氧化能力呈正相關。如圖5所示,在一定范圍內,楊樹芽提取物對DPPH·的清除率與質量濃度有一定的量效關系,濃度不斷增加的過程中,清除能力也增加。經計算,楊樹芽提取物清除DPPH·的IC50值是0.15 mg/mL,Vc的IC50值是0.023 mg/mL,IC50值越低,對應物質的抗氧化活性就越強。結果表明，楊樹芽提取物對DPPH·有較好的清除能力。

圖5 DPPH·清除能力Fig.5 The DPPH·scavenging ability

2.3.2 還原力 FRAP法測定還原力的原理是在pH<7的環(huán)境下,抗氧化物可還原鐵離子-三吡啶基三嗪(Fe3+-TPTZ),得到藍色的Fe2+-TPTZ,隨后在593 nm處測定吸光度即可通過計算得到樣品的還原力。以Trolox(水溶性抗氧化劑)作為標準品與楊樹芽提取物進行比較,可評價楊樹芽提取物的總抗氧化活性。由實驗結果可知,楊樹芽提取物的總抗氧化能力為152.1 g Trolox/kg,表明其具有較強抗氧化活性。

2.3.3 Fe2+絡合力 Ferrozine與Fe2+反應可生成藍色絡合物,而抗氧化劑與Fe2+可生成無色絡合產物,因此可將溶液色澤度作為抗氧化劑濃度的一種評價方式。抗氧化劑濃度越大,絡合力越強時,體系的藍色越淺。以Na2EDTA為標準,比較樣品的絡合力[28]。本實驗的研究結果表明楊樹芽提取物具有絡合Fe2+的能力,絡合力為271.03 g Na2EDTA/kg。這說明楊樹芽提取物具有很好的Fe2+絡合力。

2.3.4 OH·介導的DNA鏈氧化損傷的保護作用 模型組:質粒DNA+H2O2+FeSO4;實驗組:質粒DNA+H2O2+FeSO4+楊樹芽提取物(S1-S3)。

在一定場強下,DNA分子的遷移速率與其自身的大小和構型有一定關系,質粒DNA在通常情況下為雙螺旋結構(0號泳道),移動較快,當受損后,DNA可能變?yōu)殚_環(huán)或線性結構,條帶移動較慢。OH·對pBR322質粒DNA損傷程度的不同,直觀反映的便是雙螺旋在3種構象中的比例,雙螺旋結構比例越大,則OH·對DNA的氧化損傷程度越小[29,30]。本文結果如圖6，5所示,在H2O2和FeSO4的存在下,空白組中的1.95%DNA轉化為開鏈或線狀,而模型組中的68.77%DNA轉化為開鏈或線狀, 高出空白對照組約35倍。S1，S2，S3中分別是不同濃度的楊樹芽提取物,可得出，楊樹芽提取物對pBR322DNA的氧化損傷具有保護作用。隨著楊樹芽提取物濃度的增加,pBR322質粒DNA的雙螺旋結構從40.69%增加至94.42%,最高可保護94.42%的DNA免受氧化應激損傷,說明楊樹芽提取物對OH·介導DNA氧化損傷具有顯著的保護作用。這可能與楊樹芽總黃酮提取物對過渡金屬亞鐵離子有較強的絡合能力有關,也可能與楊樹芽提取物中黃酮類化合物對OH·的清除作用有關,其機理有待進一步深入研究。

注:0號泳道0.5 μgpBR322質粒DNA;1號泳道0.5 μg pBR322質粒DNA+1 μL1%H2O2+1 μL1.0mMFeSO4;2-4號泳道0.5 μg pBR322質粒DNA+1 μL1%H2O2+1 μL1.0mMFeSO4+4 μL濃度分別為1，5，15 μg/mL楊樹芽提取物。圖6 楊樹芽提取物對OH·介導pBR322DNA鏈氧化損傷的保護作用Fig.6 Protective effect of poplar bud extract on hydroxyl radical-induced cleavage of pBR322 plasmid DNA

3 結 論

本研究通過熱回流提取方法,以總黃酮提取率和抗氧化活性為考察指標,在單因素實驗基礎上,利用響應面方法優(yōu)化了楊樹芽總黃酮的熱回流提取工藝,得出楊樹芽總黃酮的最佳提取工藝為:提取時間2 h、料液比1∶16 (g/mL)、乙醇體積分數(shù)85%,該條件下楊樹芽總黃酮的提取率為13.14%。體外抗氧化實驗結果表明,楊樹芽提取物不僅可以有效地清除自由基,對過渡金屬Fe2+離子也有較強的絡合能力,楊樹芽提取物對OH·介導pBR322DNA氧化損傷也有顯著的的保護作用。本文的研究結果為楊樹芽生物資源的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

表5 楊樹芽提取物對OH·介導pBR322DNA鏈氧化損傷的保護作用Tab.5 Protective effects of poplar bud extract on hydroxyl radical-induced pBR322DNA oxidative damage

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差;3種狀態(tài)DNA所占比例是根據(jù)相對光密度計算得到?？瞻捉M:質粒DNA。