張華華,趙小鴿,繆吉玉,侯 妮,劉利英,張靜,韓繼明

(1.延安大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 陜西 延安 716000;2.西安交通大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061;3.西安交通大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究實驗中心, 陜西 西安 710061)

近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率日益增加,嚴(yán)重威脅人們的生活質(zhì)量和生命健康[1]。腫瘤患者往往由于各種應(yīng)激而出現(xiàn)抑郁情緒,后者可加重和擴展各種臨床表現(xiàn),影響甚至決定患者的病情、病程、預(yù)后和結(jié)局[2-3]。目前,抗抑郁藥開始被應(yīng)用到腫瘤的臨床治療過程中[3]，以單胺轉(zhuǎn)運蛋白為靶點的抑制單胺遞質(zhì)重攝取是當(dāng)前最成功的抑郁癥藥物治療策略[4]。

單胺轉(zhuǎn)運蛋白包括5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白(5-Serotonin transporter,SERT)、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白(Norepinephrine transporter,NET)和多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白(Dopamine transporter,DAT),是位于神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和外周交感神經(jīng)纖維支配組織器官(包括胃腸道)的Na+/Cl-依賴性遞質(zhì)轉(zhuǎn)運體[4]。由于基因多態(tài)性等因素所造成的NET，SERT功能的缺失或紊亂被證明與許多神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病、心血管疾病以及腫瘤關(guān)系甚為密切[5-8]。本研究針對NET在結(jié)腸癌中的作用,從臨床生物大數(shù)據(jù)、實際臨床標(biāo)本和人結(jié)腸癌細(xì)胞3個水平進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 臨床組織標(biāo)本采集

收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2016—2017年間經(jīng)病理組織學(xué)證實,具有完整病例資料的27例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織?；颊吣挲g26～86歲,平均61.1歲,其中男17例,女10例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及其他抗腫瘤治療,未同時患有其他惡性腫瘤;術(shù)后均準(zhǔn)確記錄腫瘤的分化程度和轉(zhuǎn)移情況,并依據(jù)結(jié)直腸癌TNM分期(第8版)標(biāo)準(zhǔn)進行分期。其中,出現(xiàn)轉(zhuǎn)移患者(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移)11 例,無轉(zhuǎn)移患者16例。上述標(biāo)本嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程制成石蠟切片。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，SW480由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室惠贈。結(jié)腸癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。實驗時,細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 主要試劑

免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購買于澳大利亞PAA公司,胎牛血清購于以色列Biolnd公司。Polyplus脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購買于上海澤邁生物技術(shù)有限公司,RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit和Real-time qPCR試劑盒SYBR Premix ExTaq購買于日本TaKaRa公司。Transwell小室購于Millicell公司。BCA蛋白定量試劑盒購買于Theromo公司。兔抗人NET抗體為Abcam公司產(chǎn)品,兔抗人MMP9抗體為Proteintech公司產(chǎn)品,兔抗人MMP2抗體為Proteintech公司產(chǎn)品,鼠抗人β-actin為SANTA CRUZ公司產(chǎn)品。

1.4 美國癌癥和腫瘤基因組圖譜大數(shù)據(jù)分析

提取美國癌癥和腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://xenabrowser.net/)中所有結(jié)腸癌(COAD)的基因表達(dá)RNAseq的數(shù)據(jù),運用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析NET的表達(dá)量與結(jié)腸癌患者的T(腫瘤大小)，N(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，M(遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移)及stage(分期)的關(guān)系。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測

表1 實驗中所用到的oligo序列Tab.1 Oligos used in the experiments.

石蠟切片常規(guī)脫蠟,抗原修復(fù)并冷卻至室溫后,3%H2O2孵育10min以消除內(nèi)在過氧化物酶活性。BSA室溫30min封閉后,滴加一抗(抗人NET,1∶50),4℃孵育過夜。PBS洗滌后滴加二抗,室溫孵育30min。PBS沖洗后行DAB顯色和蘇木素復(fù)染。梯度無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。NET以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強度綜合評分[9]:1)陽性細(xì)胞百分比,沒有陽性細(xì)胞為0分;<10%為1分,10%～50%為2分,50%～80%為3分,≥80%為4分;2)染色強度,無著色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,深棕黃色為3分;再計算兩者乘積;Wilcoxon秩和檢驗分析有轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組的NET表達(dá)差異。

1.6 NET siRNA合成、轉(zhuǎn)染及效率檢測

設(shè)計特異針對NET基因的siRNA序列(見表1),由上海吉瑪公司合成。轉(zhuǎn)染前更換培養(yǎng)基,采用Polyplus轉(zhuǎn)染法將siRNA (30nmol/L)轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細(xì)胞中并設(shè)置相應(yīng)的對照組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)至48h收集細(xì)胞行實時熒光定量PCR(qRT-RCR)檢測NET siRNA干擾效率和Western Blot檢測NET蛋白的表達(dá)差異。

1.7 qRT-RCR檢測NET siRNA干擾效率

采用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA。根據(jù)日本TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,同時用其Real-time qPCR試劑盒(SYBR法)行擴增NET基因,所需引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成,序列見表1。

1.8 Transwell遷移實驗

收集各處理組細(xì)胞,用1mL無血清培養(yǎng)基重懸,計數(shù),取6×104cells/200μL加入Transwell小室的上室,下室加入600μL含10%(體積分?jǐn)?shù))血清的培養(yǎng)基。在37℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后,取出小室,PBS洗滌,吸凈PBS。0.04g/mL多聚甲醛固定15min,0.001g/mL結(jié)晶紫染液染色30min,PBS洗滌兩遍。用棉簽輕輕拭去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞。在顯微鏡下觀察并拍照。DMSO溶解,在酶標(biāo)儀570nm處檢測各處理組OD值。獨立實驗重復(fù)3次。

1.9 Western Blot檢測NET、MMP9和MMP2蛋白表達(dá)

提取各組細(xì)胞的蛋白裂解液，用BCA法測定各組蛋白質(zhì)濃度。分別取20μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,與特異性一抗(抗人NET、抗人MMP9、抗人MMP2，體積比均為1∶500)孵育,4℃過夜。洗膜后與二抗室溫孵育1h,洗膜后與ECL化學(xué)發(fā)光劑作用并曝光和顯影。獨立實驗重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,配對樣本比較采用t檢驗,非配對樣本采用秩和檢驗。所有結(jié)果以P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NET與結(jié)直腸癌患者的轉(zhuǎn)移及分期呈正相關(guān)

利用TCGA數(shù)據(jù)庫中全部結(jié)腸癌基因表達(dá)RNAseq結(jié)果并行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中NET的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和臨床分期呈緊密相關(guān),隨患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和分期變晚,NET的表達(dá)升高(見圖1)。并收集27例結(jié)直腸癌患者的癌組織和配對正常組織,通過制備石蠟切片、行免疫組織化學(xué)染色并定量分析后,發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者的癌組織中NET的表達(dá)較配對正常組織顯著升高(見圖2A),且其升高倍數(shù)明顯高于無轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者(見圖2B)。

A 結(jié)腸癌的不同分期對NET表達(dá)的影響；B 結(jié)腸癌T分期對NET表達(dá)的影響；C 結(jié)腸癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否對NET表達(dá)的影響；D 結(jié)腸癌中遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移與否對NET表達(dá)的影響圖1 TCGA大數(shù)據(jù)分析NET與結(jié)腸癌T，N，M和分期的關(guān)系Fig.1 The analysis of NET and human colon cancerusing TCGA database

圖2 NET在結(jié)腸癌組織和其癌旁正常組織中的表達(dá) ×200(*P<0.05)Fig.2 The expression of NET in colon cancer tissuesand adjacent normal tissues ×200

2.2 下調(diào)NET的表達(dá)可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移

圖3 在人結(jié)腸癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siNET，使NET的表達(dá)量下調(diào)Fig.3 The expression of NET was decreased by siNET transfection in human colon cancer cells

NET在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中表達(dá)升高,故設(shè)計并合成了兩條針對人NET的siRNA (siNET1和siNET2),將它們與對照(siNC)分別轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480中,48h后提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。qRT-RCR檢測結(jié)果和Western Blot結(jié)果顯示,這兩條siRNA在兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞中均明顯下調(diào)了NET的mRNA和蛋白的表達(dá)量(見圖3)。運用Transwell遷移實驗觀察下調(diào)NET對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響。 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siNET1組、 轉(zhuǎn)染siNET2組細(xì)胞的遷移能力較對照組明顯下降: HCT116細(xì)胞中, 轉(zhuǎn)染siNET1組， siNET2組的穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組分別下降48.4%和26.9%; SW480細(xì)胞中, 轉(zhuǎn)染siNET1組、siNET2組的穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組分別下降53.9%和66.4%(見圖4)。

圖4 在人結(jié)腸癌細(xì)胞中，siNET使細(xì)胞遷移能力下降Fig.4 The invasion of colon caner cells was inhibited by siNET

2.3 下調(diào)NET的表達(dá)使人結(jié)腸癌細(xì)胞中MMP9蛋白減少

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,其中MMP2和MMP9表達(dá)量的改變常被用于輔助判斷腫瘤細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移能力的改變[10]。Western Blot的結(jié)果(見圖5)顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染siNET1組，轉(zhuǎn)染siNET2組的HCT116和SW480細(xì)胞中MMP2蛋白略有減少,而MMP9的蛋白表達(dá)均被明顯抑制。

圖5 在人結(jié)腸癌細(xì)胞中，siNET使MMP9表達(dá)量明顯被抑制Fig.5 The protein level of MMP9 was inhibited by siNET

3 討 論

去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白(NET)屬于神經(jīng)遞質(zhì)-鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運體家族,分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及外周器官中交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配的組織器官,包括心臟、腎上腺髓質(zhì)、胃腸道及胎盤等。NET通過重攝取由突觸前膜釋放到突觸間隙的去甲腎上腺素(NE)水平而維持突觸的穩(wěn)態(tài),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神興奮、抗抑郁藥作用機制、心血管疾病及腫瘤的治療中扮演著重要的角色。NET的功能受到多種細(xì)胞內(nèi)、外信號分子(包括cAMP-PKA，PKC等)和神經(jīng)遞質(zhì)、激素的調(diào)節(jié)[11-12]。

目前臨床上使用的抗抑郁藥物被認(rèn)為主要通過阻斷NET和SERT而達(dá)到抗抑郁的效果。近年來,抗抑郁藥物逐漸開始伴隨應(yīng)用于腫瘤治療過程中[3]。國外臨床病例回顧性研究指出,抗抑郁藥的應(yīng)用除治療患者抑郁癥狀之外,亦可改變腫瘤的發(fā)病風(fēng)險[13-15]。并且，Stopper H教授課題組通過進行體外實驗提出抗抑郁藥使結(jié)腸癌細(xì)胞出現(xiàn)G1-S阻滯,增殖減緩,出現(xiàn)凋亡，且能夠減輕由致癌物質(zhì)MNNG引起的小鼠大腸癌變,周圍組織中微血管形成減少[16]。而Kim JS教授課題組亦報道了抗抑郁藥可以通過抑制NF-κB的活性,減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,進而緩解小鼠腸炎以及腸腫瘤的形成[17]。這些研究結(jié)果均提示NET或SERT與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移能力存在相關(guān)性。在我們的實驗結(jié)果中通過對TCGA數(shù)據(jù)庫的大數(shù)據(jù)分析和實際臨床標(biāo)本的組化實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)NET在有轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者癌組織中表達(dá)明顯升高,且利用siRNA技術(shù)將NET表達(dá)下調(diào),顯著抑制了人結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力和遷移相關(guān)分子MMP9的蛋白水平。這些實驗結(jié)果與上述研究結(jié)論保持一致,說明NET參與了對人結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的調(diào)控。

腫瘤細(xì)胞的遷移能力增強是構(gòu)成腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要環(huán)節(jié)?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是在自然進化中高度保守的一類鋅離子依賴性內(nèi)肽酶,幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分;現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)26種MMP,其中MMP2和MMP9表達(dá)量的改變常被用于輔助判斷腫瘤細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移能力的改變[10, 18]。在結(jié)腸癌中MMP9被報道調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，控制腫瘤細(xì)胞的移行,與腫瘤的進展和預(yù)后緊密相關(guān)[19-20]。Notch信號通路是一種細(xì)胞間接觸依賴性的細(xì)胞通訊方式。其被活化后,釋放被兩次切割后得到的Notch蛋白的胞質(zhì)片段，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)而調(diào)節(jié)靶基因(如Snail和 NF-κB等)的表達(dá),在胚胎發(fā)育和腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起作用[21]。Notch被報道在腫瘤細(xì)胞中通過結(jié)合于MMP9的啟動子區(qū)域而啟動其表達(dá)，從而參與對腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控[22-23]。另外,Hu等研究發(fā)現(xiàn)NET基因缺陷小鼠中Numb表達(dá)增高,Notch信號通路活性減弱[24]。雷蕾等亦報道了抑郁癥患者中NET基因rs2242446位點的多態(tài)性與Numb和RBP-jk的表達(dá)量升高有關(guān),從而抑制Notch信號通路活性[6]。據(jù)此,結(jié)合我們的實驗數(shù)據(jù)我們推測,NET的表達(dá)和功能可以影響Notch信號通路,從而調(diào)控MMP9的表達(dá),進而對腫瘤細(xì)胞的遷移及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。我們的結(jié)果提示靶向NET的治療手段有可能為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療提供新的思路和方法。