徐 潤(rùn)，孫燕泥，楊 冉，唐 恬，陳春月，陽(yáng)明芳，付賢寧，寧 竣，陳靈燕，唐 瑜

(成都醫(yī)學(xué)院 1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.體溫與炎癥四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500)

精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)是由下丘腦視上核和室旁核神經(jīng)元合成的九肽激素，在體溫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用[1]。中樞或外周給予AVP引起大鼠低溫反應(yīng)，而AVP V1a受體抑制劑使大鼠體溫和棕色脂肪組織溫度升高[1- 4]。下丘腦視前區(qū)(preoptic area，POA)分布的溫度敏感神經(jīng)元參與體溫調(diào)節(jié)[5]。AVP通過(guò)激活V1a受體興奮視前區(qū)熱敏神經(jīng)元，抑制冷敏神經(jīng)元[6]。谷氨酸激活視前區(qū)α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid, AMPA)受體可以升高大鼠體溫[7]，而阻斷中樞谷氨酸促離子型受體，可以抑制外周注射AVP引起的低溫反應(yīng)[8]。在海馬、外側(cè)隔區(qū)、下丘腦室旁核和腦干等部位，AVP通過(guò)激活V1a受體抑制谷氨酸能突觸傳遞[9]，但AVP是否影響視前區(qū)AMPA受體表達(dá)尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g[成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(川)2015- 030]。

1.1.2 試劑：RNAlater和Trizol(Invitrogen公司)；DEPC(Sigma公司)。PrimeScript RT reagent Kit、FastStart Essential Probes Master(大連寶生物工程有限公司和Roche公司)；核酸染料4s red(生工生物工程股份有限公司)；TEMED、RIPA裂解液和PMSF(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；4×上樣緩沖液(Bio-Rad公司)；蛋白Marker(Thermo Fisher公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)；一抗GluR1、GluR2和GluR3(CST公司)；β-actin抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)(Abcam公司)。

1.1.3 探針與引物：熒光定量PCR檢測(cè)目的基因所使用探針(Roche公司)，所需引物為該探針庫(kù)所匹配的特異引物(表1)。引物由成都梓熙擎科生物技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分組及取材：將動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組、AVP組(10 μg/kg，腹腔注射)、阻斷劑組(V1a受體抑制劑30 μg/kg，腹腔注射)和阻斷劑+AVP組，每組均為4只大鼠。各組先注射0.9%氯化鈉溶液(saline)或V1a受體抑制劑，20 min后再注射等體積0.9%氯化鈉溶液或AVP，30 min后取材進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

表1 目的基因探針及引物序列Table 1 Probe and primer sequences of objective gene

腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，迅速開(kāi)顱取完整腦，用DEPC處理過(guò)的冰PBS沖凈血水。用振動(dòng)切片機(jī)切成300 μm下丘腦片，在解剖顯微鏡下選取視前區(qū)組織，分別存放于裝有1 mL RNAlater的離心管中。4 ℃過(guò)夜，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA含量：將保存于RNAlater的組織塊用無(wú)酶鑷子轉(zhuǎn)移至1 mL Trizol中，嚴(yán)格參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)操作，獲得RNA樣本后，使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度及純度，A260/280≈2.0。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)RNA 完整性，可見(jiàn)明亮的28 S、18 S及較淡的5 S這3條帶，無(wú)DNA 污染條帶。隨后冰上制備RT-PCR反應(yīng)體系，首先去基因組DNA，反應(yīng)體系為：5×gDNA Eraser 緩沖液 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 2 μg，加無(wú)酶水至總體系為10 μL，混勻離心后轉(zhuǎn)至PCR儀，42 ℃孵育2 min；然后在體系內(nèi)加入10 μL的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，該預(yù)混液含：PrimeScriptRT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，RT Primer Mix 4 μL，5×PrimeScriptBuffer 24 μL，RNase Free dH2O 1 μL?；靹螂x心后在PCR儀內(nèi)反應(yīng)：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄所得cDNA用于熒光定量PCR，配置預(yù)混液比例為每10 μL反應(yīng)體系含F(xiàn)astStart Essential Probes Master 5 μL，引物及探針各0.15 μL，RNase Free dH2O 1 μL，渦旋混勻后分裝于八聯(lián)管，加入2 μL cDNA模板，再次混勻離心后上機(jī)，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,讀取熒光值，循環(huán)45次；最后40 ℃延伸30 s。反應(yīng)結(jié)束后，以β-actin為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA相對(duì)含量。

1.2.3 Western blot測(cè)定蛋白表達(dá)：取出組織塊，于濾紙上吸干液體稱重，按1 g∶5 mL加入裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，剪碎組織塊，電動(dòng)勻漿，置于冰上裂解30 min，隨后4 ℃ 13 000×g離心10 min，取上清液至新的預(yù)冷的離心管中。嚴(yán)格按照BCA試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，以100 μg為標(biāo)準(zhǔn)分裝樣品，加入5 μL 4×上樣緩沖液，最后用RO H2O補(bǔ)齊體積至20 μL，渦旋震蕩混勻，100 ℃恒溫加熱10 min。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，使用4 ℃過(guò)夜的10%凝膠，電泳100 V 20 min，120 V 80 min；根據(jù)蛋白Marker指示，切下相應(yīng)范圍的膠條，轉(zhuǎn)膜，4 ℃ 200 mA 90 min，5%脫脂奶粉37 ℃封閉5 min，一抗4 ℃震蕩過(guò)夜(GluR1、GluR2和GluR3 1∶400，β-actin 1∶5 000)，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗(1∶5 000)37 ℃震蕩2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，曝光。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，計(jì)算條帶的積分光度值(IA)。結(jié)果以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量表示，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白(IA)/內(nèi)參(IA)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AVP對(duì)大鼠視前區(qū)AMPA受體亞基mRNA表達(dá)的影響

腹腔注射AVP后，大鼠視前區(qū)AMPA受體GluR1、GluR2和GluR3 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。V1a受體抑制劑使GluR2 mRNA表達(dá)量減少，而外源性AVP也沒(méi)有削弱V1a受體抑制劑下調(diào)GluR2 mRNA表達(dá)的作用，這二組大鼠視前區(qū)GluR2 mRNA表達(dá)量明顯降低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group圖1 AVP對(duì)大鼠視前區(qū)AMPA受體亞基mRNA表達(dá)的影響Fig 1 Effect of arginine vasopressin on the mRNA expression of AMPA receptor subunits in rat

2.2 AVP對(duì)大鼠視前區(qū)AMPA受體亞基蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，AVP顯著降低了大鼠視前區(qū)AMPA受體GluR3蛋白表達(dá)，并使GluR1和GluR2蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)。V1a受體抑制劑并未阻斷AVP引起的GluR1和GluR2表達(dá)上調(diào)，GluR3表達(dá)減少(P<0.05)(圖2A，B)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖2 AVP對(duì)大鼠視前區(qū)AMPA受體亞基蛋白 表達(dá)的影響Fig 2 Effect of arginine vasopressin on the protein expression of AMPA receptor subunits in rat

3 討論

下丘腦視前區(qū)溫度敏感神經(jīng)元參與維持體溫恒定，其放電受到突觸傳遞的調(diào)控[10]。整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外周注射AVP引起的低溫反應(yīng)與中樞谷氨酸促離子型受體的激活密切相關(guān)[8]。AMPA受體是中樞主要的谷氨酸促離子型受體，由GluR1- 4 4個(gè)亞基組成，其中GluR2在AMPA受體中的相對(duì)表達(dá)量決定了AMPA受體的功能特性[11]。GluR4通常在大鼠幼年期表達(dá)，在成年大鼠主要表達(dá)由GluR1- 3組成[12- 13]。

外周注射AVP引起的降溫作用與減壓反射抑制支配棕色脂肪組織的交感神經(jīng)放電，減少產(chǎn)熱有關(guān)[14]。但去除大鼠頸動(dòng)脈竇后，并沒(méi)有完全消除AVP的降溫作用[2]。阻斷中樞谷氨酸促離子型受體后，卻可抑制腹腔注射AVP引起的低溫反應(yīng)[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性AVP不影響GluR1- 3 mRNA表達(dá)，阻斷內(nèi)源性AVP后，只下調(diào)GluR2 mRNA。AMPA受體亞基蛋白變化與基因表達(dá)變化并不一致，外源性AVP增加GluR1和GluR2的蛋白表達(dá)，減少GluR3表達(dá)。可能是由于外源性AVP使GluR1和GluR2蛋白質(zhì)翻譯效率升高導(dǎo)致其mRNA表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。AMPA受體胞內(nèi)有PKC和CaMKII磷酸化位點(diǎn)[15]。V1a受體是Gq/11蛋白偶聯(lián)受體，推測(cè)AVP激活V1a受體，通過(guò)PKC和CaMKII磷酸化AMPA受體，并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性AVP增加GluR1/2蛋白，可能是AVP引起GluR1 C端的磷酸化使AMPA受體在胞內(nèi)貯積，間接導(dǎo)致GluR2蛋白水平上調(diào)；GluR1/2表達(dá)的增高又引起GluR3表達(dá)的減少，從而維持總AMPA受體亞基的平衡。V1a受體阻斷劑并未完全阻斷外源性AVP對(duì)AMPA受體亞基的作用。可能與腹腔注射的V1a受體抑制劑較難通過(guò)血腦屏障有關(guān)。激活視前區(qū)AMPA受體可以升高體溫[7]，而AMPA受體中GluR2的相對(duì)表達(dá)決定了AMPA受體的功能特性[11]。推測(cè)AVP可能通過(guò)增加視前區(qū)神經(jīng)元GluR2表達(dá)，使鈣離子通透性降低，抑制AMPA受體功能，從而影響視前區(qū)溫度敏感神經(jīng)元的放電活動(dòng)，引起低溫反應(yīng)。

綜上所述，AVP主要通過(guò)影響AMPA受體GluR1- 3蛋白表達(dá)來(lái)減少視前區(qū)AMPA受體介導(dǎo)的谷氨酸能突觸傳遞。這種對(duì)AMPA受體亞基表達(dá)的調(diào)控，為在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上觀察到的AVP對(duì)體溫的調(diào)節(jié)作用提供了一種可能的中樞突觸傳遞機(jī)制。