甄娟，劉玉東，宋春紅，朱玉芬，王莉，畢學(xué)杰

(1 石家莊市第四醫(yī)院，石家莊050000；2 河北省人民醫(yī)院)

SIAH2是一種高度保守的泛素連接酶，基因定位于染色體3q25，編碼324個(gè)氨基酸。SIAH2蛋白具有泛素連接酶的活性，可調(diào)節(jié)一些蛋白的泛素化和降解，并通過其作用的底物在細(xì)胞周期、低氧應(yīng)激及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。近年來研究[1]發(fā)現(xiàn)，SIAH2可作為一種重要的腫瘤因子，在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，SIAH2在有增殖能力的細(xì)胞中表達(dá)(正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)，如人胚腎細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及結(jié)直腸腺瘤細(xì)胞等，而在不增殖的細(xì)胞中表達(dá)缺失。SIAH2在肺癌[2]、急性T淋巴細(xì)胞白血病[3]、卵巢癌[4]、乳腺癌[5]組織中均呈高表達(dá)，并且隨著肺癌及乳腺癌分化程度的降低其表達(dá)顯著增加。Malz等[6]研究發(fā)現(xiàn)，SIAH2與肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此SIAH2是作為一種癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮其作用的。SIAH2在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義罕有報(bào)道。低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)在細(xì)胞低氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)與腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，SIAH2能夠調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)，從而使其在細(xì)胞低氧反應(yīng)及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，SIAH2可通過SIAH2/HIF-1α途徑調(diào)控腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本研究對卵巢癌組織中的SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白進(jìn)行了定性及定量檢測，觀察其表達(dá)變化，探討SIAH2在卵巢癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用及其與HIF-1α的關(guān)系，為卵巢癌的診斷和治療尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012～2017年在石家莊市第四醫(yī)院接受手術(shù)治療的卵巢癌患者57例、卵巢囊腫患者55例、卵巢交界性腫瘤患者40例，術(shù)前未接受放化療及激素治療，術(shù)中均留取腫瘤組織[其中35例卵巢癌患者手術(shù)時(shí)一并留取癌旁組織(距離癌組織>2 cm)]。腫瘤組織和癌旁組織離體后立即放入液氮-70 ℃保存，受檢時(shí)切片，先行HE常規(guī)染色后進(jìn)一步明確診斷，由兩名病理醫(yī)師根據(jù)卵巢腫瘤WHO分類標(biāo)準(zhǔn)和FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)確定腫瘤的組織病理類型及病理分期。

1.2 主要試劑 鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶S-P試劑盒和DAB顯色試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，SIAH2鼠單克隆抗體(sc-81787)和HIF-1α鼠單克隆抗體(sc-13515)均購自美國Santa Cruz公司。

1.3 卵巢癌、卵巢囊腫、卵巢交界性腫瘤患者腫瘤組織中SIAH2、HIF-1α蛋白的定性檢測 采用免疫組化SP法。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白均以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。每張受檢組織切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞，總計(jì)1 000個(gè)瘤細(xì)胞：SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白陽性細(xì)胞百分比為0計(jì)0分、≤50%計(jì)1分、>50%～≤75%計(jì)2分、>75%計(jì)3分；細(xì)胞無著色計(jì)0分、淺黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、黃褐色計(jì)3分。上述兩分值的乘積<4為陰性、≥4為陽性。

1.4 卵巢癌患者腫瘤組織及癌旁組織中SIAH2、HIF-1α蛋白的定量檢測 采用Western blotting法。受檢組織切片進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡，12%SDS-PAGE電泳，一抗(SIAH2 1∶150，HIF-1α 1∶150)和β-actin(1∶200)4 ℃孵育過夜，與相應(yīng)二抗室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光，拍照并進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析，用Image J軟件半定量分析特異性條帶的光密度值，將β-actin光密度值作為內(nèi)參照，對目的蛋白(SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白)的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌、卵巢囊腫、卵巢交界性腫瘤患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的定性檢測結(jié)果比較 卵巢囊腫、卵巢交界性腫瘤、卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率分別為7.27%和10.9%、47.5%和42.5%、78.9%和80.7%，兩兩相比，P均<0.05。卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.402，P<0.05)。卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡及腫瘤組織學(xué)類型無關(guān)(P均>0.05)，詳見表1。

表1 卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.2 卵巢癌患者腫瘤組織、癌旁組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的定量檢測結(jié)果比較 卵巢癌患者腫瘤組織、癌旁組織中SIAH2蛋白的相對表達(dá)量分別為2.518±0.18、2.016±0.142，兩者相比，P<0.05；卵巢癌患者腫瘤組織、癌旁組織中HIF-1α蛋白的相對表達(dá)量分別為1.41±0.14、0.75±0.13，兩者相比，P<0.05。卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.408，P<0.05)。

3 討論

SIAH2蛋白的作用底物包括PHD1/3、Spry2[1]、CHK2[9]、PI3K[10]等，一些底物通過自身AXVXP基因序列或銜接蛋白與SIAH2結(jié)合，一些底物直接與SIAH2結(jié)合，從而影響多種細(xì)胞功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、線粒體生物合成、低氧和應(yīng)激反應(yīng)等。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SIAH2蛋白能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，抑制SIAH2蛋白的表達(dá)可以減慢乳腺癌的生長和減少腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，推測SIAH2基因是一種癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，SIAH2蛋白在卵巢良性病變、交界性腫瘤、卵巢癌患者腫瘤組織中的陽性表達(dá)率依次升高，SIAH2蛋白在卵巢癌患者腫瘤組織中的相對表達(dá)量高于癌旁組織，推測SIAH2蛋白作為腫瘤促進(jìn)因子在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白的陽性表達(dá)隨著FIGO分期的增加而增加，且在低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白的陽性表達(dá)率較高，這與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致。推測SIAH2蛋白可以作為卵巢癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，也可以作為卵巢的藥物治療靶點(diǎn)，并且可以預(yù)測卵巢癌患者的預(yù)后。

HIF-1蛋白是非常重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，主要由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，α亞基是其主要的功能單位。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的泛素-蛋白酶系統(tǒng)能夠?qū)IF-1α蛋白降解，所以HIF-1α蛋白很難被檢測到[12]。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α蛋白穩(wěn)定性提高，濃度逐漸增加，將會啟動其下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，而HIF-1α下游靶基因的蛋白產(chǎn)物與腫瘤血管生成、浸潤轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡密切相關(guān)[13]。腫瘤在低氧時(shí)就會誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)上調(diào)，而HIF-1α表達(dá)上調(diào)就會使血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使腫瘤形成更多的新生血管，促進(jìn)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[13～16]。由此可見，HIF-1α蛋白的高表達(dá)為腫瘤細(xì)胞生長提供了血供，為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移開辟了道路，預(yù)示著腫瘤有較高的侵襲性。本研究結(jié)果顯示,HIF-1α蛋白在卵巢癌患者腫瘤組織中高表達(dá)，而且FIGO分期較晚、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者腫瘤組織中HIF-1α蛋白表達(dá)水平較高。推測HIF-1α參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

研究[4]發(fā)現(xiàn)，在急性T淋巴細(xì)胞白血病中抑制SIAH2的活性后，通過PHD3調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)，可抑制白血病細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果顯示，SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白在卵巢癌癌變過程中的陽性表達(dá)率同時(shí)依次升高，并且在卵巢癌患者腫瘤組織中二者的相對表達(dá)量均顯著高于癌旁組織，卵巢癌組織中SIAH2蛋白與HIF-1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，二者均與腫瘤分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。以上這些結(jié)果提示SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白具有協(xié)同作用，與卵巢癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)。推測HIF-1α蛋白可能是SIAH2的蛋白一種底物。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者腫瘤組織中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白高表達(dá)；SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白可能與卵巢癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)，且二者可能具有協(xié)同作用。SIAH2作為一種重要的腫瘤因子，研究其上下游調(diào)控關(guān)系，可為進(jìn)一步探討其作為卵巢癌藥物治療靶點(diǎn)及預(yù)后判斷指標(biāo)提供理論依據(jù)。