彭樺，劉利平，楊盛力，喻超，孫飛

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2深圳市人民醫(yī)院；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院；4貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

近年來(lái)研究[1～3]發(fā)現(xiàn)生物鐘基因在腫瘤組織中普遍表達(dá)異常，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2是生物鐘基因的重要成員，研究[1～3]發(fā)現(xiàn)Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2在肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，低表達(dá)的患者通常預(yù)后較差。探索引起肝癌生物鐘基因表達(dá)異常的原因有可能為遏制肝癌的發(fā)生、發(fā)展提供新的思路。有研究[4,5]發(fā)現(xiàn)HCV感染可引起肝癌細(xì)胞生物鐘基因Per2和Cry2的表達(dá)異常。我們的前期研究[6,7]結(jié)果顯示缺氧環(huán)境和乙肝病毒X蛋白可以引起肝癌細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)異常。肝癌等實(shí)體瘤除處于缺氧微環(huán)境狀態(tài)下，也常處于低糖微環(huán)境中，低糖微環(huán)境是否也是引起生物鐘基因表達(dá)異常的原因，目前研究較少。我們于2016年1月～2017年12月對(duì)肝癌患者癌組織和癌旁組織中的生物鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白的表達(dá)進(jìn)行了觀察，同時(shí)對(duì)低糖微環(huán)境中的肝癌細(xì)胞CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)進(jìn)行了觀察?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010～2011年貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的原發(fā)性肝癌患者30例；男26例，女4例；年齡23～62歲；其中合并肝硬化者17例，腫瘤直徑<3 cm者11例、≥3 cm者19例，腫瘤侵犯血管者5例、未侵犯血管者25例，腫瘤數(shù)目單個(gè)者25例、多個(gè)者5例，腫瘤高分化5例、中分化19例、低分化6例?；颊咝g(shù)前均未接受過(guò)化療、放療、免疫治療及靶向治療。患者均接受手術(shù)治療，術(shù)中留取癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上的肝組織)。留取的組織標(biāo)本10%甲醛浸泡固定24 h后石蠟包埋、切片，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。

1.2 試劑及肝癌細(xì)胞 鼠抗人Per1、Per2、Per3多克隆抗體購(gòu)于Novus公司。兔抗人CLOCK多克隆抗體、兔抗人BMAL1多克隆抗體、鼠抗人Cry1單克隆抗體、兔抗人Cry2多克隆抗體購(gòu)于Abcam公司。免疫組化試劑盒SP-9001購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。PCR引物由Invitrogen公司合成。高糖DMEM(含葡萄糖 4 500 mg/L)和低糖DMEM(含葡萄糖1 000 mg/L )購(gòu)自Hyclone公司。新生牛血清由Hyclone公司提供。人肝癌細(xì)胞系Huh7和Bel-7404細(xì)胞(Huh7和Bel-7404細(xì)胞來(lái)源不同，生物學(xué)背景不同)購(gòu)于中國(guó)典型物種保藏中心。

1.3 肝癌患者癌組織和癌旁組織中的生物鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化染色法。分別將30例肝癌患者的癌組織和癌旁組織的石蠟切片脫蠟至水，PBS清洗10 min。3%H2O2、室溫孵育15 min。PBS洗2 min×3次。將組織切片放入pH值為9.0的緩沖液中，95～96 ℃微波抗原修復(fù)20 min，室溫自然冷卻，PBS清洗2 min×3次。10%山羊血清封閉液孵育，37 ℃靜置2 h。棄去封閉液，直接滴加一抗(1∶250稀釋)，放入4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。復(fù)溫，PBS清洗2 min×3次。生物素化的二抗常溫孵育30 min，PBS清洗2 min×3次。被辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素常溫孵育15 min，PBS清洗2 min×3次。滴加DAB，纖維鏡下控制染色，自來(lái)水中止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)切片中陽(yáng)性細(xì)胞百分比和著色程度進(jìn)行綜合評(píng)分：①陽(yáng)性細(xì)胞>75%計(jì)4分、51%～75%計(jì)3分、25%～50%計(jì)2分、<25%計(jì)1分，未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分。②細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分，胞質(zhì)見(jiàn)淺黃色顆粒計(jì)1分，胞質(zhì)見(jiàn)棕黃色顆粒計(jì)2分，胞質(zhì)見(jiàn)棕褐色顆粒計(jì)3分。上述兩種評(píng)分的乘積≤4為陰性、>4為陽(yáng)性。

1.4 高糖及低糖環(huán)境中培養(yǎng)的Huh7和Bel-7404細(xì)胞中生物鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA的檢測(cè) 分別將Huh7和Bel-7404細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%融合時(shí)分別用含10%新生牛血清的高糖DMEM和含10%新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)量RNA的純度和濃度，取同量的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行10倍稀釋后作為模板?？偡磻?yīng)體系為20 μL：sybrGreen Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，10 μmol/L上游引物和10μM下游引物各1.5 μL，ddH20 7.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性1 min，40次循環(huán)內(nèi)95 ℃變性60 s、56 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s，再72 ℃延伸10 min，重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7000軟件系統(tǒng)中設(shè)定閾值和基線，測(cè)定各反應(yīng)孔的Ct值(Ct值代表基因的起始拷貝數(shù))，以2-△△Ct表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)/(Ct陰性對(duì)照-Ct內(nèi)參基因)。實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表1 受檢生物鐘基因的Real-time PCR引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者癌組織和癌旁組織中的生物鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白表達(dá)比較 肝癌患者癌組織中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白的陽(yáng)性率分別為 63.3%(19/30)、50.0%(15/30)、33.3%(10/30)、36.6%(11/30)、36.6%(11/30)、43.3%(13/30)、40.0%(12/30)，癌旁組織中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白的陽(yáng)性率分別為 56.7%(17/30)、60%(18/30)、86.7%(26/30)、90%(27/30)、86.7%(26/30)、66.7%(20/30)、77.3%(22/30)；與癌旁組織相比，癌組織中有Per1、Per2、Per3、Cry2蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)，CLOCK、BMAL1、Cry1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P均>0.05)。圖1為生物鐘基因蛋白在1例肝癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。

圖1 1例肝癌患者癌組織和癌旁組織中生物鐘基因蛋白的表達(dá)

2.2 高糖及低糖環(huán)境中培養(yǎng)的Huh7和Bel-7404細(xì)胞中生物鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)比較 高糖培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.01、0.99±0.01、1.01±0.01、1.00±0.01、0.99±0.01、1.00±0.01、1.00±0.01，低糖培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.73±0.01、0.97±0.03、0.96±0.03、0.71±0.01、0.96±0.04、1.35±0.02、1.02±0.04。高糖培養(yǎng)的Bel-7404細(xì)胞中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.01、0.99±0.01、1.00±0.01、1.01±0.01、0.99±0.01、0.99±0.01、1.00±0.01，低糖培養(yǎng)的Bel-7404細(xì)胞中CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.80±0.01、0.97±0.03、0.98±0.03、0.64±0.02、0.98±0.02、1.43±0.01、1.00±0.04。與高糖培養(yǎng)的Huh7和Bel-7404細(xì)胞相比，低糖微培養(yǎng)的Huh7和Bel-7404細(xì)胞中CLOCK、Per2 mRNA表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)，Cry1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，其余基因的表達(dá)未見(jiàn)明顯異常(P>0.05),表明低糖微環(huán)境可引起肝癌細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因的表達(dá)紊亂。

3 討論

生物鐘基因正常表達(dá)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。正常情況下轉(zhuǎn)錄因子CLOCK和 BMAL1形成異二聚體，結(jié)合到Per1～3和Cry1～2基因啟動(dòng)子上并激活其轉(zhuǎn)錄，表達(dá)產(chǎn)物Per1～3和Cry1～2系列蛋白又作為負(fù)性元件與CLOCK/BMAL1結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而阻遏Per1～3和Cry1～2的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄。由于基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白入核需要一定時(shí)間，使得生物節(jié)律分子振蕩以近24 h為周期自主進(jìn)行，生物鐘基因這種負(fù)反饋循環(huán)構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)的內(nèi)源性“分子鐘”，通過(guò)調(diào)控下游的鐘控基因使得各項(xiàng)生命活動(dòng)有條不紊地進(jìn)行[9]。

人類約40%的基因?yàn)殓娍鼗騕10]，這些基因包括細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子(Cyclin A，Cyclin B1，Cyclin D1，Wee1)、癌基因(c-myc)、抑癌基因(p53，p21)、血管生成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[11]。生物鐘基因表達(dá)紊亂，有可能引起上述基因的表達(dá)異常，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

肝癌組織中普遍存在一個(gè)或多個(gè)生物鐘基因的表達(dá)異常。Lin等[8]研究發(fā)現(xiàn)Per1、Per2、Per3 、Cry2和Tim在肝癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織中的表達(dá)。Li等[12]比較了肝癌與癌旁組織中CLOCK、BMAL1、Per1～2、Cry1～2 mRNA表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Per1 mRNA表達(dá)降低，BMAL1 mRNA表達(dá)升高，其余基因在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。我們的前期研究[7]比較了肝癌與癌旁組織中CLOCK、BMAL1、Per1～3、Cry1～2、CKIε基因mRNA表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)Per1、Per2、Per3 和Cry2在肝癌組織中的表達(dá)低于其在癌旁組織中的表達(dá)。本研究進(jìn)一步在蛋白水平上驗(yàn)證了這一結(jié)果。生物鐘基因表達(dá)紊亂和肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Lin等[8]研究發(fā)現(xiàn)Per1、Per2、Per3低表達(dá)程度與腫瘤體積相關(guān)，Tim低表達(dá)與肝癌病理分級(jí)相關(guān)。Yuan 等[13]的研究結(jié)果顯示，NPAS2基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞株和肝癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，NPAS2過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后較差。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)DEC1在高分化肝癌組織的表達(dá)明顯高于其在中分化和低分化肝癌組織中的表達(dá)，認(rèn)為DEC1可作為肝癌分化程度的標(biāo)記物。

是什么因素引起了肝癌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)紊亂呢？有文獻(xiàn)[4,5]報(bào)道HCV 核心蛋白能夠改變生物鐘基因Per2 和Cry2的表達(dá)。我們前期研究[6,7]發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒X蛋白即HBx與缺氧微環(huán)境可引起肝癌細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)紊亂。肝癌細(xì)胞除處于缺氧微環(huán)境狀態(tài)下，還因代謝旺盛，相對(duì)供血、供糖不足，處于低糖狀態(tài)。低糖微環(huán)境和肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15,16]。有研究[16]顯示，低糖狀態(tài)下肝癌細(xì)胞中多藥耐藥蛋白MDR1、MRP1和LRP的表達(dá)增多，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥性。本研究模擬肝癌體內(nèi)生長(zhǎng)的低糖微環(huán)境狀態(tài)，將人肝癌細(xì)胞株Huh7和Bel-7404細(xì)胞置于低糖微環(huán)境中生長(zhǎng)，結(jié)果顯示低糖微環(huán)境也可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)紊亂。低糖狀態(tài)下，CLOCK和Per2表達(dá)下調(diào)，Cry1上調(diào)，其中Per2的變化趨勢(shì)同其在肝癌組織中的表達(dá)狀態(tài)相一致。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中普遍存在生物鐘基因蛋白表達(dá)異常(多呈低表達(dá)狀態(tài))；肝癌細(xì)胞在低糖微環(huán)境中培養(yǎng)后，部分生物鐘基因mRNA表達(dá)下調(diào)。低糖微環(huán)境可能是導(dǎo)致肝癌細(xì)胞生物鐘紊亂的原因之一，但低糖微環(huán)境引起肝癌細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)異常的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。