李文開，鐘禮立，李云，黃寒，梁沫，易紅玲

(湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院，長(zhǎng)沙410005)

支氣管哮喘是以氣道慢性炎癥為主要特征的呼吸系統(tǒng)疾病，由多種細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及其合成和分泌的炎癥細(xì)胞因子相互作用所致，好發(fā)于兒童[1]。流行病學(xué)調(diào)查[2]顯示，兒童支氣管哮喘發(fā)病率為2%～7%。兒童支氣管哮喘急性發(fā)作可導(dǎo)致支氣管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜充血、分泌物增多等，阻塞患兒氣道，使呼吸阻力增加以及支氣管痙攣，加重患兒喘憋性呼吸困難及缺氧狀態(tài)[3]。早期診斷支氣管哮喘并及時(shí)評(píng)估病情嚴(yán)重程度，對(duì)制定針對(duì)性治療方案、改善患兒預(yù)后有重要意義。有研究[4]認(rèn)為，炎癥反應(yīng)、免疫功能異常等與支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)。去整合素金屬蛋白酶(disintegrins metalloproteinase，ADAM)8屬于解聚素和金屬蛋白酶家族成員，ADAM8與氣道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[5]。干擾素調(diào)控因子(interferon regulatory factor，IRF)1是核轉(zhuǎn)錄因子，主要介導(dǎo)了細(xì)胞免疫過(guò)程[6]。關(guān)于ADAM8、IRF1在小兒支氣管哮喘發(fā)病過(guò)程中的作用，目前相關(guān)研究相對(duì)較少。本研究觀察了支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血ADAM8、IRF1水平變化?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年6月～2018年3月湖南省人民醫(yī)院收治的支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒91例(急性發(fā)作組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組修訂的兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[7]中的第1～4條，或者滿足第4、5條。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟功能不全者；②肝、腎功能障礙者；③納入研究前的1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑治療者；④有藥物治過(guò)敏史者；⑤惡性腫瘤患者。按照“全球哮喘防治倡議”[8]標(biāo)準(zhǔn)將急性發(fā)作組患兒分為輕度組27例(男15例、女12例，年齡3～14歲)、中度組35例(男21例、女14例，年齡4～13歲)、重度組29例(男17例、女12例，年齡3～13歲)。同期隨機(jī)選取60例支氣管哮喘緩解期患兒為緩解組(男34例、女26例，年齡4～14歲)，60例健康體檢兒童為對(duì)照組(男38例、女22例，年齡3～14歲)。各組性別、年齡有可比性(P均>0.05)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象及家屬知情同意。

1.2 外周血ADAM8、IRF1 mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。收集研究對(duì)象清晨空腹肘靜脈血4 mL于EDTA抗凝管中，根據(jù)Ficoll-hypaque密度梯度離心法將外周血中單個(gè)核細(xì)胞分離，置于TRIzol(瑞士Roche公司提供)中，-80 ℃保存?zhèn)錂z。用TRIzol提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。ADAM8上游引物序列為5′-GGGAGAAACAACGAAGTTG-3′，下游引物序列為5′-GGTGTGATCAAGCACAGAT-3′，長(zhǎng)度為256 bp；IRF1上游引物序列為5′-GCGGCACCTGGCGCACGGCT-5′，下游引物序列為5′-GGTGGAAGCACCAAGAC-3′，長(zhǎng)度為128 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物序列為5′-GTGACGTGGACAATCCGCAAG-3′，下游的引物序列為5′-GGAAGGTGGACAACGGACGC-3′，長(zhǎng)度為25 bp。采用熒光定量PCR法檢測(cè)ADAM8、IRF1 mRNA。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃持續(xù)20 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)上述操作3次。ADAM8 mRNA及IRF1 mRNA表達(dá)水平采用2-ΔΔCt表示。

1.3 ADAM8、IRF1蛋白檢測(cè) 采用BCA試劑盒測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞中總蛋白，Western blotting法檢測(cè)ADAM8、IRF1蛋白，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行相關(guān)操作。

1.4 肺功能測(cè)定 采用耶格肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)各組患兒肺功能指標(biāo)，包括第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、用力呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平比較 急性發(fā)作組中的輕度組、中度組、重度組患兒外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平高于緩解組和對(duì)照組，并且輕度組、中度組、重度組患兒外周血ADAM8 mRNA、IRF1 mRNA及蛋白水平逐漸升高，見表1、2。

2.2 各組肺功能指標(biāo)比較 急性發(fā)作組中的輕度組、中度組、重度組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于緩解組和對(duì)照組，并且輕度組、中度組、重度組患兒外周血FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF逐漸降低，見表3。

表1 各組外周血ADAM8、IRF1 mRNA表達(dá)水平比較

注：與緩解組、對(duì)照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

表2 各組外周血ADAM8、IRF1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與緩解組、對(duì)照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

表3 各組肺功能指標(biāo)比較

注：與緩解組、對(duì)照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

2.3 急性發(fā)作組患兒外周血ADAM8 mRNA、IFR1 mRNA水平的相關(guān)性及其與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 急性發(fā)作組患兒外周血ADAM8 mRNA與IFR1 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.793，P<0.05)，ADAM8 mRNA水平與FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.659、-0.702，-0.683、-0.761，P<0.05)，IFR1 mRNA與FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.712、-0.735，-0.728、-0.756，P均<0.05)。

3 討論

目前，臨床主要根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)、肺功能檢查等診斷支氣管哮喘，但不能全面有效評(píng)估病情而為臨床用藥提供指導(dǎo)。同時(shí)，年齡小于6歲的患兒肺功能檢查的依從性低，以致結(jié)果不穩(wěn)定，準(zhǔn)確性相對(duì)較低。尋找簡(jiǎn)便、高效、重復(fù)性好的指標(biāo)輔助臨床診斷支氣管哮喘，對(duì)指導(dǎo)臨床制定針對(duì)性治療方案具有重要意義。

研究[9]表明，氣道炎癥與支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)，多種免疫細(xì)胞和炎癥因子介導(dǎo)了其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。ADAM是主要在免疫細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中表達(dá)的分泌型糖蛋白，其主要功能是調(diào)控炎癥細(xì)胞遷移以及參與惡性腫瘤的發(fā)病過(guò)程[10]。ADAM8屬于ADAM家族成員，具有824個(gè)氨基酸殘基膜蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜中。研究[11]顯示ADAM8過(guò)度表達(dá)參與了肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Knolle等[12]對(duì)炎癥小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，ADAM8能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡，清除肺部炎癥細(xì)胞，并進(jìn)一步推斷ADAM8具有抗炎作用。Oreo等[13]發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重哮喘患者痰液中ADAM8表達(dá)上調(diào)，并且與氣道中炎癥細(xì)胞的聚集密切相關(guān)，提示ADAM8可使哮喘患者炎癥細(xì)胞遷移至氣道。IRF是主要在細(xì)胞核中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在干擾素信號(hào)通路的作用下調(diào)控多種基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞免疫等[14]。李茉莉等[15]研究IRF1在大鼠感染呼吸道合胞病毒中的作用，證實(shí)了IRF1通過(guò)介導(dǎo)大鼠神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)表達(dá)而參與氣道炎癥的發(fā)生過(guò)程。梁雯慧等[16]發(fā)現(xiàn)IRF1表達(dá)異常參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起哮喘發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血中ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平高于緩解組和對(duì)照組，并且急性發(fā)作期患者哮喘病情越嚴(yán)重，ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平也高。進(jìn)一步比較ADAM8、IRF1蛋白在各組中的表達(dá)水平，也得到相似結(jié)果。上述結(jié)果說(shuō)明ADAM8、IRF1高表達(dá)可能通過(guò)介導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)而誘導(dǎo)支氣管哮喘的發(fā)作，并促進(jìn)病情的進(jìn)展。支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血ADAM8 mRNA與IRF1 mRNA水平呈正相關(guān)，提示兩種標(biāo)志物通過(guò)協(xié)同作用引起氣道炎癥反應(yīng)，共同介導(dǎo)支氣管哮喘的發(fā)病進(jìn)程。

支氣管哮喘急性發(fā)作對(duì)患兒肺功能造成不同程度的損傷，病情越嚴(yán)重則肺功能損傷越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒肺功能指標(biāo)FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于緩解組和對(duì)照組，并且病情越嚴(yán)重的患兒其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平越低，提示上述指標(biāo)能有效評(píng)估支氣管哮喘患兒病情嚴(yán)重程度。支氣管哮喘急性發(fā)作患兒外周血ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平與其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈不同程度負(fù)相關(guān)，說(shuō)明ADAM8、IRF1異常表達(dá)水平越高，患兒炎癥反應(yīng)越明顯，支氣管哮喘病情進(jìn)展越快，病情越重，肺功能損傷加重，提示外周血ADAM8、IRF1可作為評(píng)估支氣管哮喘病情嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志物。

綜上所述，ADAM8、IRF1異常表達(dá)介導(dǎo)了小兒支氣管哮喘急性發(fā)作的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并且與肺功能損傷程度有關(guān)，可作為臨床輔助評(píng)估小兒支氣管哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度的指標(biāo)，也可指導(dǎo)臨床用藥。