王黎，武倫，魏廣民

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院)

淋巴瘤是指來(lái)源于淋巴細(xì)胞及其前體細(xì)胞的惡性腫瘤，在我國(guó)占所有惡性腫瘤的3%～4%，且近年來(lái)其發(fā)病率呈較為明顯的上升趨勢(shì)[1]。淋巴瘤種類繁多，非霍奇金淋巴瘤(NHL)與霍奇金淋巴瘤(HL)在病理形態(tài)、免疫表型、臨床特征、治療方法和預(yù)后等方面都有很大差別[1]。按目前經(jīng)典的治療方案進(jìn)行治療，淋巴瘤患者僅有約40%可以得到長(zhǎng)期緩解，而絕大多數(shù)患者的治療效果欠佳，因此，有必要更為深入地研究淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制[2]。正常細(xì)胞通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)精密地調(diào)控著細(xì)胞分裂及增殖，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和拮抗細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)出現(xiàn)失衡，將導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，細(xì)胞有惡性轉(zhuǎn)化可能。有研究發(fā)現(xiàn)淋巴瘤細(xì)胞有特異性的生存素(survivin)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1的表達(dá)，而兩者與細(xì)胞周期的調(diào)控有著十分重要的關(guān)聯(lián)。survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族中最小的分子，被認(rèn)為是最強(qiáng)大的凋亡抑制因子[3，4]，除了胚胎組織中有表達(dá)，在正常人組織中不表達(dá)，但其在許多腫瘤中異常高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[5]。survivin蛋白在各種惡性腫瘤(如胃癌、卵巢癌、肺癌和淋巴瘤)中都不同程度的高表達(dá)，是腫瘤預(yù)后不良的重要指標(biāo)[6]。Cyclin D1是極為重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，與腫瘤細(xì)胞異常增殖有著十分密切的關(guān)系[7]。2015年3月～2017年3月，我們采用MaxvisionTM/HRP免疫組織化學(xué)染色法對(duì)61例淋巴瘤患者的病變淋巴瘤組織和28例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織中的survivin蛋白、Cyclin D1蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，觀察其表達(dá)變化?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的淋巴瘤患者61例，男42例，女19例；年齡11～86歲；病理組織分型為NHL 52例、HL 9例；Ann Arbor臨床分期為Ⅰ期22例、Ⅱ期12例、Ⅲ期17例、Ⅳ期10例；參照1993年“國(guó)際淋巴瘤預(yù)后指標(biāo)”進(jìn)行惡性程度分級(jí)，分為低度惡性淋巴瘤(Ⅰ期、Ⅱ期)34例、高度惡性淋巴瘤(Ⅲ期、Ⅳ期)27例；61例淋巴瘤患者均留取病變淋巴瘤組織。以28例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織作對(duì)照。

1.2 試劑 survivin抗體(產(chǎn)品編號(hào)RAB-0536)、Cyclin D1抗體(產(chǎn)品編號(hào)RMA-0541)、快捷免疫組織化學(xué)MaxvisionTM/HRP檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)Kit-5030)、DAB染色試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)Kit-0016)均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 survivin蛋白、Cyclin D1蛋白的檢測(cè)方法 采用MaxvisionTM/HRP免疫組織化學(xué)染色法。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)方法、具體操作步驟、判定方法及標(biāo)準(zhǔn)同文獻(xiàn)[8]。survivin蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈淡黃、棕黃或棕褐色顆粒(陽(yáng)性)，細(xì)胞質(zhì)不著色或著色淺且不特異者為陰性。Cyclin D1蛋白主要定位在細(xì)胞核，呈淡黃、棕黃或棕褐色顆粒(陽(yáng)性)，細(xì)胞核不著色或著色淺且不特異者為陰性。以陽(yáng)性細(xì)胞<25%為低表達(dá)、≥25%為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確概率法，等級(jí)相關(guān)資料分析用非參數(shù)Spearman檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴瘤患者的病變淋巴瘤組織、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織中survivin蛋白與Cyclin D1蛋白的定位及表達(dá)比較 淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織中survivin蛋白染色細(xì)胞較少，淋巴瘤患者的病變淋巴瘤組織中survivin蛋白染色細(xì)胞呈彌漫性或灶性分布。61例淋巴瘤患者的病變淋巴瘤組織survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為57.38%(35/61)、28例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴瘤組織陽(yáng)性表達(dá)率為21.43%(6/28)，兩者相比，χ2=9.982，P<0.01。

淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織中Cyclin D1蛋白染色細(xì)胞較少，淋巴瘤患者的病變淋巴結(jié)組織中Cyclin D1蛋白染色細(xì)胞多且主要位于細(xì)胞核內(nèi)。61例淋巴瘤患者的病變淋巴結(jié)組織Cyclin D1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為39.34% (24/61)、28例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織陽(yáng)性表達(dá)率為0 (0/28)，兩者相比，χ2=13.152，P<0.01。

2.2 淋巴瘤組織中survivin蛋白、Cyclin D1蛋白表達(dá)與淋巴瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 survivin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴瘤患者年齡、性別、HL/NHL、免疫表型、B組癥狀及結(jié)外累計(jì)部位數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)，而與血清乳酸脫氫酶(LDH)水平升高、臨床分期高及惡性程度高有明顯相關(guān)性(P均<0.05)。Cyclin D1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、年齡、結(jié)外累計(jì)部位數(shù)、血清LDH水平升高、HL/NHL及免疫表型無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)，與B組癥狀、臨床分期高及惡性程度高有明顯相關(guān)性(P均<0.05)。結(jié)果詳見表1。

表1 淋巴瘤組織中survivin蛋白、Cyclin D1蛋白表達(dá)與淋巴瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 淋巴瘤組織中survivin蛋白與Cyclin D1蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在61例淋巴瘤患者中，其淋巴瘤組織中survivin蛋白與Cyclin D1蛋白均呈陽(yáng)性表達(dá)18例，survivin陽(yáng)性表達(dá)而Cyclin D1陰性表達(dá)17例，survivin陰性表達(dá)而Cyclin D1陽(yáng)性表達(dá)6例，survivin蛋白與Cyclin D1蛋白均呈陰性表達(dá)20例，survivin、Cyclin D1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.287，P<0.05)

3討論

survivin是從人類基因組中篩選出的一個(gè)基因[1]。survivin作為凋亡抑制家族的重要成員之一，主要通過(guò)拮抗腫瘤細(xì)胞的凋亡、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。本研究結(jié)果顯示，28例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織中survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為21.43%，61例淋巴瘤患者的病變淋巴結(jié)組織中survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為57.38%，淋巴瘤組織中survivin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞呈彌漫性或灶性分布，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相符。survivin蛋白可促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞逃避生長(zhǎng)監(jiān)視，提高細(xì)胞存活能力，有助于促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，survivin蛋白的高表達(dá)與淋巴瘤患者的性別、年齡、HL/NHL、免疫表型、B組癥狀及結(jié)外累計(jì)部位數(shù)多無(wú)明顯相關(guān)性，而與血清LDH水平高、臨床分期高及惡性程度有明顯相關(guān)性，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。有研究[9]表明，survivin基因在大多數(shù)常見惡性腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌及前列腺癌，并與其相應(yīng)的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期有著十分緊密的關(guān)聯(lián)。有研究[1]報(bào)道，利用RNA干擾技術(shù)抑制survivin基因的表達(dá)，可誘導(dǎo)人HL-60白血病細(xì)胞凋亡。結(jié)合本研究，我們推測(cè)在survivin或許也可作為淋巴瘤基因治療的新靶點(diǎn)。

Cyclin D1蛋白是一個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)核蛋白，主要參與促進(jìn)細(xì)胞周期的G1期進(jìn)入S期[12]。G1/S期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控閥門，而Cyclin D1蛋白是調(diào)控該閥門的一個(gè)重要因素。Cyclin D1在促進(jìn)細(xì)胞增殖中起著十分重要的作用[13]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶與Cyclin D1蛋白結(jié)合，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。往往在細(xì)胞周期的G1期僅合成少量的Cyclin D1蛋白[14]。然而在部分腫瘤細(xì)胞中，由于喪失對(duì)部分基因的控制，導(dǎo)致Cyclin D1蛋白過(guò)度表達(dá)。Cyclin D1蛋白大量表達(dá)可縮短G1期，加快G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)程[8]。Cyclin D1基因過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞增殖速度增強(qiáng)，可能為細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了契機(jī)[15]。因此，在細(xì)胞增殖和分化中，Cyclin D1基因起著十分重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，28例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的病變淋巴結(jié)組織中Cyclin D1蛋白染色細(xì)胞較少，陽(yáng)性表達(dá)率為0，而在61例淋巴瘤患者的病變淋巴結(jié)組織中Cyclin D1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為39.34%，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道相符，提示Cyclin D1蛋白高表達(dá)可能是淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中十分重要的生物學(xué)標(biāo)志。Cyclin D1蛋白的過(guò)度表達(dá)與患者性別、年齡、結(jié)外累計(jì)部位數(shù)、LDH增高、HL/NHL及免疫表型無(wú)明顯相關(guān)性，與B組癥狀、臨床分期高及惡性程度有明顯相關(guān)性，進(jìn)一步提示Cyclin D1蛋白高表達(dá)可能是淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)標(biāo)志。Cyclin D1蛋白異常表達(dá)與腫瘤的關(guān)系十分密切，其在消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多種惡性腫瘤中亦呈過(guò)度表達(dá)[14]。在目前對(duì)淋巴瘤診斷較難的情況下，檢測(cè)Cyclin D1對(duì)淋巴瘤的診斷和惡性程度判斷有重要參考價(jià)值。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束開始到下一次分裂完畢所經(jīng)過(guò)的整個(gè)過(guò)程，分為間期與分裂期(M期)兩個(gè)階段。間期又分為三期，即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。Cyclin D1是細(xì)胞周期中G1/S期的關(guān)鍵性限制點(diǎn)，survivin是細(xì)胞周期中G2/M期的關(guān)鍵性限制點(diǎn)[8]。細(xì)胞周期的正常運(yùn)行過(guò)程中，survivin、Cyclin D1基因?qū)ζ溥M(jìn)行嚴(yán)密的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，淋巴瘤患者的淋巴瘤組織中，survivin蛋白與Cyclin D1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。推測(cè)兩者可能在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，survivin蛋白與Cyclin D1蛋白在淋巴瘤組織中均呈高表達(dá)，兩者有可能成為淋巴瘤診斷的標(biāo)志物，并可協(xié)助判斷淋巴瘤的惡性程度，二者在淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮協(xié)同作用。