蘆 潔 陳垚志 李玉琳 劉卓慧 馬 珂 王綠婭 杜 杰

表1 cDNA合成反轉(zhuǎn)錄特異引物序列

注：RT primer：反轉(zhuǎn)錄引物

主動脈夾層(aortic dissection，AD)是由于主動脈壁內(nèi)膜和中層撕裂，形成內(nèi)膜撕裂口，使中層直接暴露于血管腔，主動脈腔內(nèi)血液在動脈壓的驅(qū)動下，經(jīng)撕裂口直接穿透病變的中層，使中層分離而形成，是一種極為嚴重的大動脈疾病。其發(fā)病急、進展快、病死率高，若未及時救治，急性AD發(fā)生后48 h 內(nèi)，病死率高達50% ～68%，3個月內(nèi)病死率可達90%[1-2]。目前，AD的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)技術(shù)，但是臨床表現(xiàn)缺乏特異性，而影像學(xué)診斷往往不夠迅速，臨床現(xiàn)有生物標志物中D-dimer應(yīng)用較普遍，敏感度很高但特異度較差[3]，AD初期誤診率高達25%～50%[4]。據(jù)文獻報道循環(huán)微小核糖核酸(microRNA)有作為心血管疾病生物標志的潛能。因此，目前臨床急需一種生物標志物可以提高AD診斷的靈敏度和特異性。根據(jù)過以往文獻報道篩選出5個生物學(xué)功能可能與AD病理機制相關(guān)且在血清中表達量較高microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)，本研究旨在探討這5個血清microRNA作為新型生物標志物在AD診斷中的價值。

資料與方法

1.一般資料 選擇2015年9月至2016年3月期間在北京安貞醫(yī)院就診并最終確診為AD患者60例為AD組，其中男性45例，女性15例，平均年齡(51.95±11.47)歲。同時選取年齡性別匹配的在北京安貞醫(yī)院體檢顯示健康者60 例為對照組(HC組), 其中男44例，女16例，平均年齡為(52.28±9.88) 歲。AD診斷標準：基于超聲心動圖或主動脈CT血管成像檢查或者手術(shù)發(fā)現(xiàn)確診[5]。AD排除標準：AD患者伴隨有先天性心血管疾病、妊娠、系統(tǒng)性炎癥疾病、肝功能異常、腎功能異常、馬方綜合征、心力衰竭、腫瘤、冠心病者；創(chuàng)傷性或醫(yī)源性夾層；未接受影像學(xué)檢查(CT或TEE)；無入院D-dimmer檢測結(jié)果；無可用血清樣本。本研究經(jīng)北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組人員均簽署知情同意書。

2. 微小核糖核酸檢測 (1)血清收集與處理 抽取AD患者入院24h內(nèi)外周全血3mL，對照組常規(guī)采血，經(jīng)2 000g離心15min后取上清液于無RNA酶(RNase-free)EP管，分裝后置于-80℃低溫冰箱保存。所有樣本統(tǒng)一按照mirVana miRNA isolation 試劑盒說明書提取血清miRNA，為了防止RNA降解，在提取RNA前加入RNAlater。

(2)微小核糖核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA 采用Life公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配置為：2μL dNTP(2.5mM each)，2μL 10XRT Buffer，0.3μL RT特異引物(1μM)(表1)，200ng Total RNA，0.2μL MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)，0.3μL RNA酶抑制劑(40μ/μL)，20μL無RNA酶水。配置好體系后在PCR擴增儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為16℃ 30min，42℃ 40min，85℃ 5min。反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用。

(3)熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)擴增cDNA 采用Life公司的qRT-PCR試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)，采用Taqman HT7900熒光定量PCR儀進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃，10min；40個PCR循環(huán)(95℃，10s；60℃，60s)。反應(yīng)體系為8μL反應(yīng)體系(5 μL 2×Master Mix，0.5μL 10μmol/L的PCR特異引物F，0.5μL 10μM 的PCR特異引物R)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進行-Ramp Rate為0.05℃/s)。

(4)血清microRNA表達量計算 各樣品中5個目的miRNA和內(nèi)參U6分別進行qRT-PCR反應(yīng)。采用2- △△ CT法計算5個microRNA在血清中的相對表達量。

3. 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23 軟件進行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗分析計量資料正態(tài)性，計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差表示,兩組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗，非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(M)及四分位數(shù)間距(P25，P75)表示。兩組間比較采用兩獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(百分數(shù))表示,兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。5個microRNA血清相對表達量在兩組間的比較通過對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換后以散點圖展現(xiàn)。通過繪制受試者工作(ROC)曲線評價5個microRNA單獨或聯(lián)合對于AD的早期診斷價值，用邏輯回歸模型擬合多個microRNA的聯(lián)合診斷，根據(jù)約登指數(shù)確定截斷值，以曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標評價microRNA的診斷價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組間基線資料比較 HC組與AD組在年齡、性別、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、血脂水平、血糖水平和腎功能指標比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AD組體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、D-二聚體(D-dimer)、C反應(yīng)蛋白(C-reaction)水平高于HC組(P<0.05, 表2)。其中BMI并未報道過與AD有關(guān)，D-dimer和CRP都是已知在AD中上升的因子，與既往報道一致，且與本文研究的5種microRNA無相關(guān)性。

表2 兩組間基線資料比較

2.兩組間5個血清microRNA表達水平比較 通過qRT-PCR方法檢測HC組和AD組中5個血清microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)的相對表達水平變化，兩組間比較結(jié)果顯示，與HC組相比，5個血清microRNA相對表達水平在AD組均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05, 圖1)。

3.ROC曲線分析單個血清microRNA區(qū)分兩組的診斷效能 ROC曲線區(qū)分AD組和HC組，5個血清microRNA的曲線下面積(AUC)均>0.7(P均<0.05)，其中has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p的AUC>0.9，分別為0.915(95%CI:0.862～0.968)、0.912(95%CI:0.862～0.962)和0.910(95%CI:0.860～0.960)，另外has-miR-21-5p和has-miR-223-3p的AUC分別為0.732(95%CI:0.642～0.822)和0.717(95%CI:0.618～0.815)，結(jié)果顯示5個血清microRNA均對AD組和HC組有較好的區(qū)分能力。為了發(fā)掘臨床潛在應(yīng)用價值，根據(jù)約登指數(shù)確定各microRNA 的截斷值，同時分析靈敏度和特異度，這些指標顯示5個microRNA均有較好的臨床診斷價值(圖2，表3)。

圖1 兩組間5個血清microRNA表達水平比較

圖2 單個血清5種microRNA區(qū)分兩組的ROC曲線 注：AUC：曲線下面積

4.ROC曲線分析聯(lián)合多個血清microRNA區(qū)分兩組的診斷效能 根據(jù)單個microRNA的ROC曲線分析，選出AUC>0.9的3個microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p)聯(lián)合為Signaturea，5個microRNA全部聯(lián)合為Signatureb，通過ROC曲線分析多個microRNA聯(lián)合對于區(qū)分AD組和HC組的診斷效能。Signaturea將AUC提升至0.958(95%CI:0.924～0.992，P<0.05)，診斷靈敏度和特異度均較高。Signatureb將AUC提升至0.964(95%CI:0.935～0.993，P<0.05)，診斷靈敏度高達96.67%，診斷特異度也較高。各指標分析結(jié)果顯示Signaturea和Signatureb相比于單個microRNA的診斷效能有較大提升(圖3，表3)。

圖3 聯(lián)合多個microRNA區(qū)分兩組的ROC曲線 注：Signaturea：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p；Signatureb： has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR- 143-3p +has-miR-21-5p + has-miR-223-3p；AUC：曲線下面積

microRNAAUC95%CIP值△AUCP值截斷值靈敏度/%95%CI特異度/%95%CIas-miR-26a-5p0.9150.862～0.968<0.00010.0430.04144<0.4378.3365.8～87.995.0086.1～99.0has-miR-191-5p0.9120.862～0.962<0.00010.0460.02289<1.6991.6781.6～97.275.0062.1～85.3has-miR-143-3p0.9100.860～0.960<0.00010.0480.00766<0.2383.3371.5～91.788.3377.4～95.2has-miR-21-5p0.7320.642～0.822<0.0001<0.5368.3355.0～79.771.6758.6～82.5has-miR-223-3p0.7170.618～0.815<0.0001<0.578.3365.8～87.971.6758.6～82.5Signaturea0.9580.924～0.992<0.0001<0.6286.6775.4～94.193.3383.8～98.2Signatureb0.9640.935～0.993<0.0001<0.3096.6788.5～99.683.3371.5～91.7

注：Signaturea：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p；Signatureb：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p + has-miR-21-5p + has-miR-223-3p；△AUC及其P值是基于has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p分別與Signaturea比較的結(jié)果

討 論

AD發(fā)病急、病情進展快、病死率高、預(yù)后差, AD患者及時診斷和及時治療可以提升一年生存率超過50%[6]，因此AD患者早期診斷至關(guān)重要。診斷AD的傳統(tǒng)方法主要有經(jīng)食道超聲(transesophageal echocardiography, TEE)、主動脈CTA、MRI 及血管造影，但檢查耗時長、價格昂貴且需搬運患者。如果患者體內(nèi)存在金屬植入物，傳統(tǒng)的方法也不能進行診斷[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)一些可用于AD診斷的候選生物標志物，如D-二聚體水平對AD診斷具有極高的靈敏度，但特異性較低(46.6%～68.6%)，誤診率高；平滑肌肌球蛋白重鏈(smMHC)和可溶性彈性蛋白片段(sELAF)靈敏度和特異性較高，但在臨床緊急情況下不可行，通過目前已有的生物標志物想要實現(xiàn)AD快速準確診斷較難。因此，臨床上急需找到具有高靈敏度和高特異度的生物標志物以快速準確地診斷AD。

近年來研究表明，血清microRNA在心血管發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。microRNA是一類非編碼微小分子RNA，長約20bp，功能主要為調(diào)節(jié)基因的表達，參與細胞生長、增殖、分化等生命過程，在不同生理或病理狀態(tài)下呈現(xiàn)差異性表達，并具有組織器官特異性[7]，有作為某些疾病診斷或預(yù)測標志物的潛能。例如，Matsumoto等[8]發(fā)現(xiàn)血清miR-192，miR-194和miR-34a的水平能夠預(yù)測AMI后缺血性HF發(fā)生, Anke 等[9]也發(fā)現(xiàn)MiR423-5p 可作為HF診斷的生物標志物。

AD 發(fā)病最重要的病理及生理機制為主動脈中層的彈力纖維、膠原蛋白變性，隨著內(nèi)膜破裂形成血腫，可撕開變性壞死的中層，導(dǎo)致夾層的形成并破裂。血流動力學(xué)改變使主動脈壁彈力纖維和膠原纖維變形，血管壁彈性下降，血管內(nèi)膜易被撕裂而形成動脈夾層，嚴重時可導(dǎo)致破裂出血。據(jù)先前的研究報道， miR-26a-5p可以抑制血管平滑肌細胞的分化和凋亡，促進增殖和遷移，促進平滑肌由合成表型向收縮表型轉(zhuǎn)換增多[10]，miRNA-143-3p可調(diào)節(jié)平滑肌的表型轉(zhuǎn)化和血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[11]，所以miR-26a-5p和miRNA-143-3p表達降低可能促進AD的形成；miR191-5p通過激活NF-κB信號通路有效地抑制血管生成[12]，miR-223-3p通過影響RPS6KB1 / HIF-1α信號通路來抑制血管生成[13]，所以miR-191-5p和miR-223-3p表達下降可能抑制夾層破裂后血管的修復(fù)過程；miRNA-21-5p調(diào)節(jié)心臟成纖維細胞中的ERK-MAP激酶信號傳導(dǎo)途徑，對血管結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)整有重要作用，所以miRNA-21-5p表達下降可能影響血管結(jié)構(gòu)纖維化而導(dǎo)致夾層發(fā)生[14]?；谶@些microRNA已知的生物學(xué)功能，我們猜測它們可能與AD的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)，但是具體這5個microRNA可能參與了AD發(fā)生發(fā)展的哪一環(huán)節(jié)有待探究，不能確定AD的是因還是果。所以我們探討了這5種microRNA在AD血清中的表達。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)5種microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)在AD患者血清中表達水平顯著降低(P<0.05)。ROC曲線分析顯示5個microRNA診斷AD的AUC均在0.7以上，其中has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p診斷AD的AUC可達0.9以上，且靈敏度和特異度均較高。將多個microRNA聯(lián)合進行ROC曲線分析，AUC>0.9的3個microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p)聯(lián)合和全部5個microRNA聯(lián)合可分別將AUC提升至0.958和0.964，且靈敏度和特異性也得到較大的提升，說明將多個microRNA聯(lián)合診斷AD效果更好。我們的研究結(jié)果表明，血清microRNA有極大的潛能可以作為生物標志物應(yīng)用于AD的早期快速診斷。但是，本次研究也存在以下局限性：①本次研究樣本數(shù)量較少，仍需要進一步擴大樣本驗證以及更深入的分析來進一步驗證血清microRNA在AD診斷上的潛在價值；②血清microRNA檢測的費用較高，檢測方法需要較先進的技術(shù)，實際應(yīng)用有一定難度，距離運用于臨床診斷仍有較長的路要走。③本研究并未比較AD與其他有相似癥狀的急診患者比如肺栓塞或急性心肌梗死患者中5種microRNA的表達差異，有待后續(xù)探究。

總之，我們的研究結(jié)果表明血清microRNA有作為AD早期快速診斷生物標志物的應(yīng)用潛能，也為進一步探索血清microRNA對于AD的早期診斷價值提供了數(shù)據(jù)理論支持。