林翠紅，劉光輝，楊田野，趙 利，王 航，史常旋，孟 春

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州 350004)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells, VECs)為血管管壁的內(nèi)襯細(xì)胞，是血管重要的組成部分，具有復(fù)雜的代謝過(guò)程和生理功能。既往體內(nèi)外研究表明，VECs在心血管疾病及腫瘤新生血管形成等病理生理活動(dòng)中有重要作用[1-3]。目前，VECs體外研究中常用的原代細(xì)胞來(lái)自大鼠主動(dòng)脈，但其分離、純化、培養(yǎng)方法仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良、優(yōu)化，建立了一種簡(jiǎn)單、高效的大鼠主動(dòng)脈VECs分離、純化及培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性清潔級(jí)SD大鼠5只，體質(zhì)量(45±5)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)1988年頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2主要試劑與耗材及儀器ECM培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM；美國(guó)ScienCell公司)，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS；美國(guó)Hyclone公司)，青鏈雙抗(10 kU/mL青霉素+10 mg/mL鏈霉素；上海碧云天生物技術(shù)研究所)，胰蛋白酶(美國(guó)Santa Cruz公司)，Ⅰ型膠原酶、明膠(美國(guó)Sigma公司)，vWF兔多克隆抗體(von Willebrand factor vWF；美國(guó)Santa Cruz公司)，CD31兔多克隆抗體、第Ⅷ因子兔多克隆抗體(北京博奧森)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(上海碧云天)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole DAPI；北京中杉金橋公司)。6孔板及培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning公司)。眼科顯微手術(shù)器械(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)NUARE公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3VECs的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所用器具均經(jīng)滅菌處理，所有操作均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。脫椎處死SD大鼠，將其置于含有750 mL/L乙醇的燒杯中浸泡消毒5 min。快速打開大鼠胸腹腔，分離出主動(dòng)脈，置于含有PBS(含1%青鏈雙抗，下同)的6 cm直徑單孔培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。在眼科顯微角膜剪、鑷子及虹膜恢復(fù)器的輔助下，輕輕去除血管外周脂肪、結(jié)締組織。漂洗3次去除外部雜質(zhì)及血細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至裝有PBS的備用單孔培養(yǎng)皿中。

將血管浸沒(méi)于PBS中，用顯微鑷夾住血管遠(yuǎn)端內(nèi)約3 mm處的管壁組織，保持遠(yuǎn)端管口自然張開。另一手持顯微針持夾取尖的細(xì)縫衣針，將血管遠(yuǎn)端從管壁外側(cè)頂入遠(yuǎn)端管口內(nèi)。交替松開和夾持血管壁，將血管遠(yuǎn)端從遠(yuǎn)端管腔內(nèi)逐漸遞向近端管腔，自近端管口翻轉(zhuǎn)出內(nèi)膜，使得血管內(nèi)膜暴露在外。漂洗3次去除殘留的血細(xì)胞，吸棄多余PBS。

采用消化壓片法處理翻轉(zhuǎn)的血管組織，并設(shè)置單純消化法組和單純壓片法組進(jìn)行觀察對(duì)比。消化壓片法組：加入2 g/L Ⅰ型膠原酶2 mL，37 ℃下消化30 min后棄去，加入適量含血清培養(yǎng)基終止消化。將主動(dòng)脈剪成20～25段1.0 mm左右長(zhǎng)度的血管段，轉(zhuǎn)移至用10 g/L明膠預(yù)先包被好的6孔板中央，每孔4～5段。用滅菌的蓋玻片蓋在血管段上方，輕輕下壓，每孔加入2 mL含200 mL/L胎牛血清的ECM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。單純消化法組：培養(yǎng)的血管段不進(jìn)行蓋玻片壓片處理，余處理措施同消化壓片法組。單純壓片法組：血管組織不進(jìn)行膠原酶消化，余處理措施同消化壓片法組。

將接種各組主動(dòng)脈血管片段的6孔板置于50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)，72 h內(nèi)禁止移動(dòng)孔板。3 d后更換培養(yǎng)基，以后每2 d換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底80%左右時(shí)進(jìn)行差異消化法傳代。消化時(shí)棄去原培養(yǎng)基，PBS清洗1遍，加入2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃下消化2 min左右，顯微鏡下觀察到VECs細(xì)胞收縮變圓、細(xì)胞間隙變大，而雜質(zhì)細(xì)胞變化尚不明顯時(shí)，吸棄胰蛋白酶，加入培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打孔板底部，促使VECs脫壁，并將消化細(xì)胞按照1∶3的比例接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)，或者儲(chǔ)存于―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4細(xì)胞鑒定形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式。取第3代近融合VECs，采用第Ⅷ因子、vWF和CD31等細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行免疫熒光鑒定，激光共聚焦顯微鏡下拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1VECs的生長(zhǎng)特性消化壓片法組和單純消化法組的VECs在接種后48～72 h開始遷移出血管段，以血管段為中心貼壁生長(zhǎng)。VECs前期遷移速度較慢，細(xì)胞呈梭形；后期遷移速度加快，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈長(zhǎng)梭形或多角形。孵育6 d時(shí)，鏡檢見消化壓片法組遷移出來(lái)的細(xì)胞數(shù)較單純消化法組多，而單純壓片法組至第16天時(shí)才可觀察到近似數(shù)目的細(xì)胞遷移生長(zhǎng)(圖1A、D、G)；經(jīng)過(guò)連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是前期VECs的遷移速度，還是后期細(xì)胞集落的形成速度，消化壓片法組都明顯快于單純消化法組和單純壓片法組(圖1)。

消化壓片法組約6 d即可形成中等大的細(xì)胞集落，部分區(qū)域形成VECs典型的“網(wǎng)格狀”或“管腔樣”結(jié)構(gòu)(圖1A和圖1B)。原代VECs 10～11 d可達(dá)到近融合狀態(tài)(80%～90%融合)，此時(shí)細(xì)胞排列緊密，單層貼壁，呈現(xiàn)VECs典型的“鋪路石”樣特征(圖1C)。以1×105/mL密度傳代后的VECs在24 h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，5 d后細(xì)胞即可鋪滿整個(gè)孔板，形成單層的密集細(xì)胞群落。連續(xù)培養(yǎng)至第10代，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。

圖1不同實(shí)驗(yàn)組VECs生長(zhǎng)情況的鏡下觀察

Fig.1 The growth of primary VECs in different groups

A～C：消化壓片法組；D～F：?jiǎn)渭兿ńM；G～I(xiàn)：?jiǎn)渭儔浩ńM。A、D、G：VECs從組織塊中遷移出來(lái)，繞其周邊生長(zhǎng)(消化壓片法組和單純消化法組孵育6 d，單純壓片法組孵育16 d)；B、E、H：遷移出的VECs形成典型的“管腔樣”結(jié)構(gòu)(消化壓片法組和單純消化法組孵育8 d，單純壓片法組孵育18 d)；C、F、I：近融合的細(xì)胞集落中VECs排列緊密，呈“鋪路石”樣特征(消化壓片法組和單純消化法組孵育11 d，單純壓片法組孵育21 d)。標(biāo)尺=100 μm。

此外，取―80 ℃保存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，24 h后90%的細(xì)胞貼壁，換液洗去未貼壁細(xì)胞，顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞呈梭形或多邊形，散在分布，胞質(zhì)透亮，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)3 d后增殖速度加快，需每天換液以保證充分的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給。

2.2VECs形態(tài)及免疫學(xué)鑒定分離獲得的細(xì)胞單層生長(zhǎng)，散在分布的單個(gè)細(xì)胞呈梭形、多角形或不規(guī)則形，生長(zhǎng)到一定階段后出現(xiàn)VECs特有的細(xì)胞集落形態(tài)，初期為相互交聯(lián)的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，后期形成中空的管腔樣集落，進(jìn)一步融合后呈現(xiàn)類似鋪路石的密集細(xì)胞群落形態(tài)，有接觸抑制。根據(jù)其形態(tài)特征、生長(zhǎng)方式可初步判定為VECs。

取消化壓片法組第3代VECs進(jìn)行細(xì)胞鑒定，免疫熒光結(jié)果(圖2)顯示呈VECs形態(tài)的細(xì)胞其原代及子代細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)VECs細(xì)胞標(biāo)記物第Ⅷ因子(圖2 I)、vWF(圖2 J)和CD31(圖2 K)，陽(yáng)性率高達(dá)99%。其他2組的鑒定結(jié)果相同(未附圖)。本研究免疫鑒定至第8代，細(xì)胞標(biāo)志物均呈陽(yáng)性表達(dá)(未附圖)。

圖2VECs免疫熒光鑒定

Fig.2 Immunofluorescence of VECs

A～D：DAPI核染；E：第Ⅷ因子陽(yáng)性表達(dá)；F：vWF陽(yáng)性表達(dá)；G：CD31陽(yáng)性表達(dá)；H：陰性對(duì)照；I～L：復(fù)合圖。標(biāo)尺=50 μm。

3 討 論

VECs位于血管管壁內(nèi)層，是組成血管的關(guān)鍵細(xì)胞成分，具有重要的生理功能，可充當(dāng)機(jī)體天然屏障；參與免疫反應(yīng)；調(diào)節(jié)內(nèi)分泌；發(fā)揮凝血功能；控制血管滲透性；抵抗細(xì)胞黏附等[4-6]。此外，VECs還與炎癥、心血管疾病、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種病理過(guò)程密切相關(guān)[1-2]。目前，VECs已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域日益關(guān)注的研究對(duì)象[7-8]。為促進(jìn)VECs體外相關(guān)研究的開展，進(jìn)一步明確其在各種生理病理活動(dòng)中所起的作用，建立一套簡(jiǎn)單、高效的方法以獲得高細(xì)胞量、高純度的VECs至關(guān)重要。

既往已有各種VECs體外分離、純化、培養(yǎng)及應(yīng)用研究的報(bào)道。大鼠為實(shí)驗(yàn)室最常用的模型動(dòng)物，現(xiàn)已成功地從大鼠的肺[9]、腦[10]、心臟[11]及視網(wǎng)膜[12]等組織血管中分離出VECs，而其中以主動(dòng)脈VECs的分離培養(yǎng)最為常見[13-18]。1963年，MARUYAMA等[19]首次成功從人臍靜脈分離出VECs，但未對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞鑒定。1973年，JAFFE等[20]改良了靜脈VECs分離方法，并首先確立了相關(guān)的細(xì)胞鑒定指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，我國(guó)的張寶庚[21]于1985年首次成功培養(yǎng)了大鼠主動(dòng)脈VECs。COLE等[22]也于1986年采用植塊法獲得了成功。但是，由于雜質(zhì)細(xì)胞混雜等問(wèn)題的存在，VECs的純化一直較為困難。因此，ANDRE等[23]在1991年時(shí)提出酶消化并輔以機(jī)械刮除法進(jìn)行純化，該方法在提高VECs遷移速率的同時(shí)，能較好地排除雜質(zhì)細(xì)胞的污染，但易造成細(xì)胞損傷。為了使VECs達(dá)到研究所需的細(xì)胞純度并保持良好的細(xì)胞活力，1994年，NICOSIA等[24]將植環(huán)法用于大鼠主動(dòng)脈VECs的分離培養(yǎng)并取得了成功。免疫磁珠法(MACS)在VECs分選實(shí)驗(yàn)中的最早運(yùn)用見于1997年DONG等[25]的報(bào)道，而在2001年，KEVIL等[26]則采用酶消化法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(FACS)對(duì)主動(dòng)脈VECs進(jìn)行免疫鑒定和純化。這類方法較好地提高了VECs的細(xì)胞純度，但受MACS分選成本高昂、FACS操作復(fù)雜等因素限制，其推廣應(yīng)用受到了一定的阻礙。為此，2004年，林澤絢等[27]在植環(huán)法的基礎(chǔ)上采用瞬間熱處理以抑制外膜雜質(zhì)細(xì)胞活性，從而提高VECs純度。2008年，外翻結(jié)扎法因其僅使血管內(nèi)壁暴露在外從而較好地隔離了雜質(zhì)細(xì)胞而被肖瓊等[28]采用。2012年，季政等[18]則將血管外剖法與酶消化法結(jié)合進(jìn)一步改良了大鼠主動(dòng)脈VECs的分離、純化方法。本研究作者之前也重復(fù)了這些改良方法，發(fā)現(xiàn)其確實(shí)可以給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了一定的便利，但是培養(yǎng)出的細(xì)胞增殖能力有限，分離、純化等操作過(guò)程仍有待優(yōu)化、改進(jìn)。

目前，已報(bào)道的大鼠主動(dòng)脈VECs多取材自成年大鼠，而成年大鼠的細(xì)胞增殖能力較幼鼠的增殖能力弱[29]。本研究選用45 g左右的SD大鼠為實(shí)驗(yàn)材料。該階段大鼠為3周齡左右，具有獨(dú)立的存活能力，易于獲得。更重要的是，其胸腹主動(dòng)脈較鼠齡更小的大鼠發(fā)育更成熟，便于剖離、翻轉(zhuǎn)，組織具有優(yōu)越的細(xì)胞成熟性和細(xì)胞活性，能充分滿足分離培養(yǎng)的要求，可獲得數(shù)量多、增殖快的原代細(xì)胞[30]。

本研究的關(guān)鍵之一在于如何簡(jiǎn)便獲取有效的、高活性的主動(dòng)脈血管片段用于培養(yǎng)。既往研究在處理主動(dòng)脈時(shí)或選用植塊法或植環(huán)法將組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，或借助鑷子及針線使血管外翻并結(jié)扎兩端僅暴露出血管內(nèi)壁，或縱向剖開血管使內(nèi)壁直接貼附于孔板底部，結(jié)合酶消化法加快細(xì)胞遷移等辦法[16,18,28]。本研究對(duì)既往文獻(xiàn)報(bào)道的方法[16,28]進(jìn)行了改進(jìn)，采用了血管外翻植環(huán)法+酶消化法+壓片聯(lián)合法來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。在分離主動(dòng)脈血管后，采用細(xì)縫衣針簡(jiǎn)化外翻操作，最大限度地減小了血管內(nèi)壁損傷，并在消化后利用顯微剪將組織分成動(dòng)脈環(huán)，轉(zhuǎn)移至6孔板培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行壓片處理。

本研究發(fā)現(xiàn)，血管外翻植環(huán)法+酶消化法+壓片聯(lián)合法的操作使得VECs的遷移速度加快，細(xì)胞活性高。剖離出整條血管后外翻，使血管內(nèi)壁完全暴露，膠原酶均勻覆蓋在內(nèi)壁血管四周進(jìn)行短時(shí)間的充分消化，產(chǎn)生了具有良好活性的血管片段。研究中觀察到，消化組細(xì)胞的遷移速度明顯高于未消化組，且經(jīng)過(guò)多組多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，消化時(shí)間可準(zhǔn)確控制，重復(fù)性好。同時(shí)，壓片法使得組織塊與孔板的接觸更為緊密，有助于提高前期細(xì)胞的遷移速度，消化壓片法組在第6天時(shí)即可觀察到明顯的網(wǎng)格狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而單純消化法組則在第8天時(shí)才可觀察到類似集落。此外，該聯(lián)合法獲取的細(xì)胞量大，增殖快。研究中經(jīng)酶消化、分剪后的血管片段可以鋪放多孔，而且血管片段可以重復(fù)利用。同時(shí)根據(jù)細(xì)胞遷移情況，鋪孔的血管片段在第1次孵育4～5 d后即可轉(zhuǎn)移至新孔再次培養(yǎng)。本研究觀察到血管片段持續(xù)轉(zhuǎn)移3次培養(yǎng)后仍有VECs遷移出，且可快速增殖形成集落。不僅如此，壓片后的組織塊遷移出的細(xì)胞還可同時(shí)在孔板底部和玻片上生長(zhǎng)，細(xì)胞量翻倍，單次分離實(shí)驗(yàn)可獲得的細(xì)胞數(shù)量多。

如何獲取高純度的VECs則是本研究的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。本方法在血管外翻消化培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，配合ECM培養(yǎng)基篩選和差異消化法控制，明顯提高了VECs的純度。主動(dòng)脈管壁內(nèi)膜主要由單層的VECs和很薄的一層結(jié)締組織構(gòu)成，快速、簡(jiǎn)單操作避免內(nèi)膜的機(jī)械損傷，結(jié)合低濃度、短時(shí)間的膠原酶內(nèi)壁單面消化，既避免了中膜損傷導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的遷移[31-32]，又排除了血管外壁其他組織碎屑的影響，阻礙了大部分外壁雜質(zhì)細(xì)胞的遷移。同時(shí)，ECM培養(yǎng)基營(yíng)造的低糖且含內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充因子(ECGS)的環(huán)境，使VECs得以在最適宜的環(huán)境條件中成為主體細(xì)胞，遷移速度快、數(shù)量多。更在傳代時(shí)輔以差異消化法控制，將傳代后的VECs轉(zhuǎn)移至新的孔板中，能夠較有效地清除平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞并抑制其生長(zhǎng)。

通過(guò)上述方法培養(yǎng)獲得VECs后，進(jìn)一步在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上結(jié)合免疫熒光法對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。培養(yǎng)過(guò)程中，觀察到細(xì)胞形態(tài)為梭形或多角形，存在接觸抑制現(xiàn)象，生長(zhǎng)到一定密度后會(huì)呈現(xiàn)典型的“網(wǎng)格狀”或“管腔樣”結(jié)構(gòu)，這與既往研究報(bào)道的VECs的細(xì)胞形態(tài)特征、生長(zhǎng)特性相符，初步表明該方法分離到的細(xì)胞是VECs。為進(jìn)一步確定其細(xì)胞類型，本研究選擇第Ⅷ因子、vWF和CD31共3種VECs細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行免疫鑒定。第Ⅷ因子作為最早運(yùn)用于鑒別內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白因子，從20世紀(jì)70年代起已被廣泛運(yùn)用[33]。而vWF，即第Ⅷ因子相關(guān)抗原，在動(dòng)物體內(nèi)僅有內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞及巨核細(xì)胞能夠表達(dá)該蛋白，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，是VECs與血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞相區(qū)別的特異性抗原，常作為鑒別VECs的特征之一[33-34]。另外，CD31蛋白，又稱血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(PECAM-1)存在于內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處，參與血管生成，與VECs在心血管疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能有關(guān)[35]，是VECs重要的細(xì)胞標(biāo)記物。此3種標(biāo)記物常見于國(guó)內(nèi)外關(guān)于VECs鑒定的各類文獻(xiàn)中，具有可比性。同時(shí)，由于大鼠胸腹主動(dòng)脈的細(xì)胞成分較為簡(jiǎn)單，此3種標(biāo)記物用于鼠胸腹主動(dòng)脈VECs鑒定具有相對(duì)的特異性。本研究熒光共聚焦結(jié)果顯示，分離到的細(xì)胞皆呈第Ⅷ因子、vWF和CD31陽(yáng)性表達(dá)，且陽(yáng)性率接近99%，充分證明該改良方法獲得的細(xì)胞確為高純度的VECs。

綜上所述，本研究成功建立了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的大鼠主動(dòng)脈VECs分離、純化、培養(yǎng)方法，將為體外研究VECs的病理生理機(jī)制及其在相關(guān)疾病中的作用提供了極大的方便。