魯翰林，宋盈瑩，申春蘋(píng)，陳晨，劉小草，馮超，盧斌峰，朱一蓓，孫中文，王雪峰

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州215009；3.蘇州大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江蘇蘇州215123）

細(xì)胞因子IL-1超家族成員中的IL-36γ可顯著促進(jìn)CD8+T、自然殺傷細(xì)胞等抗腫瘤免疫細(xì)胞的功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)［1］，但單一的免疫療法往往并不能徹底抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，探討IL-36γ聯(lián)合化療藥物實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的協(xié)同抑制作用，可推進(jìn)其在腫瘤治療中的應(yīng)用。紫杉醇是臨床上常用化療藥物，通常作為有絲分裂的抑制劑，直接殺傷腫瘤細(xì)胞并促使腫瘤細(xì)胞凋亡［2］。然而，紫杉醇對(duì)機(jī)體免疫功能也會(huì)產(chǎn)生一定的抑制作用。因此，在開(kāi)展腫瘤免疫治療的同時(shí)，如何合理有效地聯(lián)合運(yùn)用紫杉醇等化療藥物，值得探討分析。

本研究擬借助IL-36γ抗腫瘤的治療模型，在進(jìn)一步分析IL-36γ對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，探討不同劑量紫杉醇對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用的影響，為采用基于IL-36γ的免疫治療和化療藥物的聯(lián)合治療模式，從策略和方法上提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠黑色瘤B16細(xì)胞株（ATCC公司，美國(guó)）；C57BL／6J 6～8周齡雌鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物合格證編號(hào)：201800310）。紫杉醇（美國(guó)Selleckchem公司）；RPMI 1640（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（美國(guó) Gibco公司）；限制性?xún)?nèi)切酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物（日本TaKaRa公司）；瓊脂糖（法國(guó)Biowest公司）；PCR反應(yīng)試劑盒（日本TaKa-Ra公司）；氨芐西林和DH5α感受態(tài)細(xì)胞（上海生工生物工程公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化科技公司），Trypsin 0.05%EDTA、Lipofectamine 2000、G418（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；RNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒（英濰捷基貿(mào)易有限公司）；真核表達(dá)載體pCDEF3由美國(guó)匹茲堡大學(xué)Lawrence Kane實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)［1］。

1.2 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的制備

設(shè)計(jì)并經(jīng)金唯智生物科技有限公司合成含有人CD8信號(hào)肽序列和具有完全活性的鼠IL-36γ片段（G13至S164）編碼區(qū)的融合基因片段，將其插入真核表達(dá)載體pCDEF3構(gòu)建成重組表達(dá)載體pCDEF3-IL-36γ。通過(guò)Bam HⅠ和NotⅠ雙酶切插入目的基因片段IL-36γ、PCR檢測(cè)目的基因片段IL-36γ和基因測(cè)序?qū)CDEF3-IL-36γ進(jìn)行鑒定。將 pCDEF3-IL-36γ用脂質(zhì)體常規(guī)轉(zhuǎn)染至小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株，加入600μg／mL的G418進(jìn)行加壓篩選，待存活的細(xì)胞克隆長(zhǎng)出后采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，將亞克隆培養(yǎng)后長(zhǎng)出的細(xì)胞采用RT-qPCR鑒定目標(biāo)基因IL-36γ，從而獲得高表達(dá)IL-36γ的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 B16-IL-36γ；同時(shí)，將空載體 pCDEF3轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞株，構(gòu)建成B16-vec作為對(duì)照。進(jìn)一步采用培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)法鑒定B16-vec、B16-IL-36γ這2種轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的生長(zhǎng)速度。

1.3 荷瘤小鼠模型的構(gòu)建和分組處理

將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的B16-vec、B16-IL-36γ細(xì)胞于腹部外側(cè)皮下接種C57BL／6小鼠，每組5只，每只小鼠注射2×105個(gè)細(xì)胞／100μL。在聯(lián)合紫杉醇進(jìn)行治療的小鼠實(shí)驗(yàn)中，將B16-vec、B16-IL-36γ細(xì)胞按上述方法分別接種C57BL／6小鼠，每種細(xì)胞接種4組小鼠，每組5只，在第0，3，7，14，21，28天分別腹腔注射不同劑量紫杉醇溶液100 μL（紫杉醇含量為0，12.5，25，100μg）。

1.4 電子數(shù)顯卡尺檢測(cè)腫瘤直徑并觀察小鼠生存期

小鼠接種腫瘤細(xì)胞當(dāng)天記為第0天，每?jī)商觳捎秒娮訑?shù)顯卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的長(zhǎng)和寬，并計(jì)算直徑。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查標(biāo)準(zhǔn)，小鼠腫瘤直徑超過(guò)20 mm以上即停止進(jìn)一步測(cè)量和實(shí)驗(yàn)。按此標(biāo)準(zhǔn)，由于荷瘤小鼠中B16-IL-36γ腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度比B16-vec細(xì)胞緩慢，其腫瘤直徑的檢測(cè)時(shí)間得以延長(zhǎng)一段時(shí)間。以B16-vec為對(duì)照組，繪制兩組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)小鼠腫瘤組織干擾素γ（IFN-γ）mRNA的表達(dá)

分別取12.5μg和100μg紫杉醇處理過(guò)的B16-IL-36γ腫瘤組織，進(jìn)行裂解并提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green qPCR試劑盒，在95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s和60℃退火1 min條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)IFN-γmRNA的表達(dá)量。β-肌動(dòng)蛋白上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′，下 游 引 物：5′-TGTAGTTTC-ATGGATGCCACAG-3′；IFN-γ上游引物：5′-CCTGCGGCCTAGCTCTGAG-3′， 下 游 引 物： 5′-GCCATGA GGAAGAGCTGCA。以 β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，計(jì)算2-ΔCT值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)IL-36γ基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其鑒定

成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pCDEF3-IL-36γ。雙酶切和PCR鑒定結(jié)果顯示，目標(biāo)基因片段成功插入了載體（圖1A和圖1B）。進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果證實(shí)，所插入的目標(biāo)基因片段序列正確。在此基礎(chǔ)上將pCDEF3-IL-36γ用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 B16細(xì)胞株，通過(guò)G418篩選、亞克隆和RT-qPCR鑒定，最終獲得高表達(dá)IL-36γ的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株B16-IL-36γ（圖C）。

圖1 B16-IL-36γ基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

2.2 IL-36γ對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及荷瘤小鼠生存期的影響

腫瘤直徑測(cè)量結(jié)果顯示，與對(duì)照組（B16-vec）相比，B16-IL-36γ分泌表達(dá)的IL-36γ能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，在腫瘤接種的第17天，B16-vec組腫瘤直徑平均為（19.15±0.70）mm，B16-IL-36γ為（7.15±0.46）mm（t＝31.98，P＜0.01）；同時(shí)，B16-IL-36γ表達(dá)的IL-36γ能顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。然而，對(duì)腫瘤進(jìn)一步的測(cè)量和觀察表明，B16-IL-36γ腫瘤在接種的第21天后發(fā)生迅速生長(zhǎng)，至第33天達(dá)到18.48mm，至第52天85%的小鼠死亡；同時(shí)對(duì)照組在第25天全部死亡。見(jiàn)圖2。上述結(jié)果說(shuō)明在腫瘤局部釋放的IL-36γ只能在一定時(shí)間內(nèi)延緩腫瘤的生長(zhǎng)。

2.3 紫杉醇對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用及免疫應(yīng)答功能的影響

聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇治療結(jié)果顯示，紫杉醇對(duì)小鼠B16-vec腫瘤的生長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著影響，較高劑量紫杉醇（25和100μg組）在腫瘤生長(zhǎng)的后期明顯抑制IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用，而較低劑量紫杉醇（12.5μg組）則對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用產(chǎn)生了一定的協(xié)同效應(yīng)。見(jiàn)圖3。

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS處理的對(duì)照組比較，低劑量紫杉醇（12.5μg組）可顯著促進(jìn)B16-IL-36γ腫瘤中IFN-γmRNA的表達(dá)，而高劑量紫杉醇（100μg組）則明顯抑制了IFN-γmRNA的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖2 IL36γ對(duì)小鼠B16腫瘤直徑及荷瘤小鼠生存期的影響

3 討論

腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答往往處于被抑制狀態(tài)，采用有效手段恢復(fù)、激活腫瘤中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的活性有助于抑制腫瘤進(jìn)展。細(xì)胞因子是免疫系統(tǒng)重要的組成部分，對(duì)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。一些白細(xì)胞介素如IL-12，IL-15和IL-21等在激活腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞活性、抑制腫瘤進(jìn)展方面具有顯著效應(yīng)。

IFN-γ是腫瘤免疫應(yīng)答中重要的功能性指標(biāo)，可上調(diào)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，促進(jìn)CD8+T、Th1等抗腫瘤免疫細(xì)胞的功能。IL-1家族成員對(duì)IFN-γ、一氧化氮合酶（NOS）、黏附分子等免疫分子的表達(dá)具有調(diào)控作用。作為IL-1家族成員，IL-36具有 IL-36α（IL-1F6）、IL-36β（IL-1F8）和 IL-36γ（IL-1F9）3種亞型，擁有共同的受體IL-36R。IL-36可通過(guò)激活NF-κB和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）途徑產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、蛋白酶等炎癥介質(zhì)，同時(shí)這些調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子也能夠發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。IL-36能激活體內(nèi)固有和獲得性免疫反應(yīng)，并在調(diào)節(jié)免疫耐受和自身免疫炎癥之間的平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-36也能上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞表面的CD80、CD86和MHCⅡ，并誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌 IL-12、IL-1、IL-6、TNF-α和 IL-23。此外，IL-36還能夠促進(jìn)細(xì)胞分泌免疫炎癥因子IFN-γ等，使浸潤(rùn)腫瘤的T細(xì)胞或引流淋巴結(jié)中的T細(xì)胞分化成具有效應(yīng)功能的T細(xì)胞，從而發(fā)揮抗原特異性T細(xì)胞抗腫瘤的效應(yīng)［4-5］。因此，IL-36亞家族成員可有效恢復(fù)、激活腫瘤中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的活性，從而有助于抑制腫瘤的進(jìn)展。

本研究通過(guò)制備穩(wěn)定表達(dá)IL-36γ的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株和構(gòu)建小鼠B16荷瘤模型，闡明了分泌表達(dá)于腫瘤中的IL-36γ能顯著抑制B16腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期。但這種抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果是暫時(shí)的，后期腫瘤仍然迅速生長(zhǎng)，這可能與后期IL-36γ激活、誘導(dǎo)的效應(yīng)性T細(xì)胞因免疫卡控點(diǎn)分子PD-1、TIM-3等上調(diào)而導(dǎo)致功能耗竭有關(guān)，也可能同時(shí)與免疫抑制性細(xì)胞群體如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）數(shù)量增加而密切相關(guān)，其中的詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。因此，在此基礎(chǔ)上，尋求合適的手段與IL-36γ進(jìn)行聯(lián)合運(yùn)用，進(jìn)一步促進(jìn)或維持IL-36γ激活的T細(xì)胞功能、消除或降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與MDSCs的抑制作用，對(duì)探討、開(kāi)辟腫瘤治療新途徑和新方法具有重要的理論指導(dǎo)意義。

紫杉醇具有抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂和阻礙紡錘體形成的作用［6-7］。此外，紫杉醇尚具有免疫調(diào)節(jié)功能。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，低劑量紫杉醇對(duì)腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等均具有調(diào)控作用［8］。因此，在采用IL-36γ進(jìn)行腫瘤免疫治療時(shí)，給予合適劑量的紫杉醇可能有助于提高IL-36γ抗腫瘤免疫應(yīng)答作用。但由于化療藥物，特別是在劑量較大的情況下，對(duì)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答具有抑制作用，所以有必要摸索合適的紫杉醇給藥劑量，以保證既能在一定程度上發(fā)揮其直接的抑腫瘤作用，又能協(xié)同促進(jìn)IL-36γ抗腫瘤免疫應(yīng)答。

因此，我們進(jìn)一步探討了不同劑量紫杉醇對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用的影響。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)采用的劑量范圍內(nèi)，紫杉醇對(duì)無(wú)IL-36γ過(guò)表達(dá)的B16腫瘤生長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著影響。這可能與所采用紫杉醇劑量尚不足以抑制B16生長(zhǎng)有關(guān)。值得注意的是，較低劑量紫杉醇則對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用產(chǎn)生了一定的協(xié)同效應(yīng)，這可能與低劑量紫杉醇在一定程度上促進(jìn)了腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的功能有關(guān)，也可能與紫杉醇介導(dǎo)了對(duì)MDSCs的抑制作用有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究［9］。然而，較高劑量的紫杉醇對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用產(chǎn)生了抑制作用，這可能與化療藥物在大劑量存在的情況下，對(duì)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答也同時(shí)具有抑制和破壞性作用有關(guān)［10］。對(duì)腫瘤中IFN-γmRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了較高劑量紫杉醇對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤免疫功能具有抑制作用，而低劑量紫杉醇則對(duì)其介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答具有促進(jìn)作用。

綜上，本研究初步揭示了不同劑量紫杉醇對(duì)IL-36γ介導(dǎo)的抗腫瘤作用會(huì)產(chǎn)生抑制或協(xié)同促進(jìn)兩個(gè)相反的影響，這為采用IL-36γ聯(lián)合化療藥物治療腫瘤，從策略和方法上提供了理論基礎(chǔ)。