湯夢(mèng)雨，徐文婷，王彩紅，王利紅

（張家港市中醫(yī)醫(yī)院生殖科，江蘇蘇州215600）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）指妊娠前糖代謝正?；蛴袧撛诘奶悄土繙p退，妊娠期才出現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)的糖尿病，是一種常見(jiàn)的妊娠期疾病。目前隨著診斷方式的改進(jìn)以及產(chǎn)檢的普及，GDM檢出率在不斷增高。國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，IFGO）指出，有大約1／6的新生兒是由GDM母親分娩的［1］。研究表明GDM易導(dǎo)致巨大兒、難產(chǎn)和產(chǎn)道損傷，增加剖宮產(chǎn)率，且GDM患者羊水過(guò)多的發(fā)病率也顯著高于正常女性，從而增加了胎膜早破和早產(chǎn)的發(fā)生率［2］。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看來(lái)，GDM患者產(chǎn)后發(fā)展為2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)也比正常人高。對(duì)于GDM患者的子代，GDM患者孕期宮內(nèi)高糖，體內(nèi)代謝的紊亂，在胎兒發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，持續(xù)刺激胎兒并且產(chǎn)生長(zhǎng)期影響，這種影響被叫作“代謝記憶”，這種“代謝記憶”效應(yīng)可使后代在成年后發(fā)生2型糖尿病以及肥胖相關(guān)的代謝綜合征的概率高于正常人［3］。然而目前尚未對(duì)GDM的病因及其對(duì)子代不良影響的機(jī)制有完善的結(jié)論，研究模型局限性較大，因此建立穩(wěn)定、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)性GDM動(dòng)物模型具有重要的意義。本研究探究建立GDM大鼠模型的優(yōu)化方案，旨在為GDM的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)6周齡Wistar大鼠90只，其中雌鼠60只，雄鼠30只，體重130～161g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）。40%脂肪飼料（上海普路騰生物科技有限公司），配方為普通繁殖鼠料54.6%、豬油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、預(yù)混料2.1%、麥芽糊精2.2%。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用大鼠均飼養(yǎng)于通風(fēng)良好，溫度控制在22～26℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%的屏障系統(tǒng)內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飲食。定期更換墊料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，改為高脂飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)8周后禁食不禁水12 h，尾尖取血測(cè)血糖，空腹血糖≥6.67 mmol／L者剔除。剔除后剩余大鼠按雌雄2∶1合籠過(guò)夜，次日早晨雌鼠陰道涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)精子記為妊娠第1天，未孕雌鼠繼續(xù)與雄鼠合籠，標(biāo)記孕鼠，記錄孕期。

1.3 分組與造模

所獲42只孕鼠，在高脂飲食基礎(chǔ)上，隨機(jī)分為對(duì)照組10只以及 STZ不同劑量（15、25、35和45 mg／kg）造模組各8只，禁食12 h后STZ不同劑量組分別一次性腹腔注射不同劑量STZ（用0.1 mmol／L、pH為4.2的枸櫞酸緩沖液配成1%的濃度），對(duì)照組注射同等劑量枸櫞酸緩沖液（0.1 mol／L，pH＝4.2）。注射 STZ 3 d后測(cè)空腹血糖介于6.67～16.67 mmol／L為 GDM大鼠造模成功［3］。造模完成后繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 體重 分別于STZ注射后3 d和18 d稱量體重。

1.4.2 空腹血糖 分別于注射STZ前、STZ注射后3 d、7 d及18 d采集尾尖血，血糖儀檢測(cè)空腹血糖。

1.4.3 成模率與死亡率 成模率＝各組造模成功孕鼠數(shù)量／各組孕鼠總數(shù)×100%；死亡率＝各組死亡孕鼠數(shù)量／各組孕鼠總數(shù)×100%。

1.4.4 孕鼠及仔鼠的一般情況 記錄子鼠數(shù)量及體重。

1.4.5 組織HE染色 孕鼠25周齡處死，HE染色觀察正常孕鼠及成模孕鼠肝臟組織、胰腺及脂肪細(xì)胞的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 孕鼠體重的變化

各組孕鼠造模前體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注射STZ后18 d，15 mg／kg組孕鼠體重與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，25、35、45 mg／kg組與對(duì)照組比較均明顯減輕（均 P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 孕鼠空腹血糖的變化

注射STZ前各組大鼠空腹血糖水平無(wú)明顯差異。對(duì)照組造模后3 d、7 d、18 d血糖與造模前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。15 mg／kg組造模后3 d、7 d、18 d血糖與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。25 mg／kg組注射STZ 3 d、7 d、18 d后血糖與對(duì)照組相比均明顯升高（P＜0.05）。注射 STZ 3 d后45 mg／kg組的空腹血糖均高于20mmol／L，注射STZ 7 d后35 mg／kg組的平均空腹血糖高于16.67 mmol／L，兩組血糖均高于6.67～16.67 mmol／L的成模標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表2。

表1 注射STZ前后孕鼠體重的變化±s，g

表1 注射STZ前后孕鼠體重的變化±s，g

*：P＜0.01，與對(duì)照組比較

對(duì)照組10 263.7±9.5 10 317.8±28.9 54.1±9.6 STZ 15 mg／kg 8 266.8±9.0 8 303.8±9.1 37.0±4.9 25 mg／kg 8 265.9±7.9 7 293.1±7.6* 27.3±2.0 35 mg／kg 8 266.5±8.4 6 275.5±13.0* 9.0±7.1 45 mg／kg 8 263.7±15.0 3 203.0±7.2* -60.7±8.5 F值0.212 25.576 P值 ＞0.05 ＜0.01

表2 注射STZ前后孕鼠空腹血糖的變化±s，mmol／L

表2 注射STZ前后孕鼠空腹血糖的變化±s，mmol／L

*：P＜0.05，與對(duì)應(yīng)天數(shù)的對(duì)照組比較

對(duì)照組 10 4.31±0.29 10 4.19±0.52 4.71±0.30 4.80±0.50 0.656 ＞0.05 STZ 15 mg／kg 8 4.09±0.51 8 4.84±0.83 5.38±1.94 4.59±0.78 1.730 ＞0.05 25 mg／kg 8 3.90±0.69 7 7.07±0.90*9.67±4.53*6.86±2.50* 6.125 ＜0.05 35 mg／kg 8 4.36±0.38 6 13.94±5.72*18.40±4.00*14.32±3.03*18.897 ＜0.01 45 mg／kg 8 4.50±0.35 3 22.37±3.65*29.70±0.52*26.57±1.46*269.777 ＜0.01 F值0.685 42.425 65.180 111.245 P值0.607 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各組的成模率及死亡率

15 mg／kg組未出現(xiàn)孕鼠死亡但成模率僅為12.5%，25 mg／kg組 成 模 率 最 高 且 死 亡 率 為12.5%，35 mg／kg及45 mg／kg組成模率低且死亡率均較高。見(jiàn)表3。

表3 成模率與死亡率

2.4 孕鼠及仔鼠一般情況

25、35及45 mg／kg組均出現(xiàn)了明顯的“三多一少”糖尿病癥狀，45 mg／kg組62.5%的孕鼠死亡，并且所產(chǎn)仔鼠膚色呈暗紫色，活動(dòng)力較差。35及45 mg／kg組所產(chǎn)仔鼠數(shù)量較其余3組明顯減少且出現(xiàn)死胎、流產(chǎn)和巨大胎等異常發(fā)育情況。見(jiàn)表4。

2.5 各組大鼠肝臟、胰腺組織及脂肪細(xì)胞的變化

HE染色結(jié)果顯示，成模組肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞輕度至中度脂肪變性，并伴有輕度局灶炎細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)個(gè)別肝細(xì)胞變性壞死。成模組的胰腺胰島輕度至中度萎縮，外泌腺腺泡輕度變性萎縮并伴有輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)及胰島細(xì)胞輕度變性。成模組脂肪細(xì)胞體積輕度增大。見(jiàn)圖1。

表4 各組所產(chǎn)子鼠情況

圖1 大鼠肝臟、胰腺和脂肪組織病理形態(tài)（HE染色×200）

3 討論

目前對(duì)實(shí)驗(yàn)型GDM大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)的判定尚不統(tǒng)一，有研究使用大劑量STZ注射使模型的空腹血糖普遍高于16.67 mmol／L，但成模后導(dǎo)致孕鼠的死亡率、流產(chǎn)率、子代低體重、畸形率增高且血胰島素水平下降［4-7］，與人類GDM的表現(xiàn)不符。所以本次研究選用輕度糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)（6.67～16.67 mmol／L）作為成模標(biāo)準(zhǔn)，有利于觀察GDM對(duì)母體及子代的長(zhǎng)期影響［8］。

本次研究通過(guò)觀察注射STZ前后體重及血糖的波動(dòng)情況來(lái)確定最穩(wěn)定的造模方式，因大鼠的妊娠期一般在21 d左右，故本次研究觀察妊娠后期注射第18天的血糖及體重變化判斷造模的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示25 mg／kg劑量的STZ聯(lián)合8周高脂飼料喂養(yǎng)的造模方式不僅能使血糖維持在6.67～16.67 mmol／L的輕度糖尿病水平，且成模率高，死亡率較低。而低劑量（15 mg／kg）的STZ注射組成模率過(guò)低。高劑量組（35 mg／kg、45 mg／kg）的孕鼠空腹血糖水平較高，成模率較低，并且死亡率高。HE染色顯示，成模孕鼠肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞輕度至中度脂肪變性及局灶炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變，胰腺胰島出現(xiàn)輕度至中度萎縮及外泌腺腺泡輕度變性萎縮等變化，脂肪細(xì)胞則出現(xiàn)了輕度體積增大。此次研究我們發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)時(shí)間高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合中等劑量STZ的注射不僅可以減少大劑量藥物注射對(duì)大鼠機(jī)體的損害以及避免高死亡率，還可以降低血糖波動(dòng)幅度，使模型穩(wěn)定在較高的血糖水平，從而得到較穩(wěn)定的GDM大鼠模型。

STZ是目前應(yīng)用于誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型的常用藥物之一，其機(jī)制是特異性地破壞胰島β細(xì)胞，引起胰島素分泌功能障礙［9］。單純使用STZ造模，血糖不易控制，與臨床實(shí)際不符。研究顯示，高脂可通過(guò)引起外周組織的胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞合成以及分泌胰島素的功能減退甚至衰竭，從而導(dǎo)致失代償引起血糖升高［10］。高脂飼養(yǎng)與人類臨床GDM的發(fā)病機(jī)制類似，但存在周期長(zhǎng)、成模率低、個(gè)體差異大的缺陷。故本研究采用高脂飲食聯(lián)合STZ注射的方法，不僅避免了單純高脂飼養(yǎng)造模需要較長(zhǎng)時(shí)間周期的成本，同時(shí)也可減少單純大劑量STZ注射的不良影響。

GDM不僅會(huì)影響婦女，更會(huì)對(duì)其子代造成不利影響。高血糖與不良妊娠結(jié)局（Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome，HAPO）研究結(jié)果提出，隨著婦女妊娠期血糖水平的升高，其發(fā)生早產(chǎn)、子癇前期、臍血C肽水平升高、新生兒低血糖、新生兒高膽紅素血癥、新生兒入ICU等的風(fēng)險(xiǎn)也隨之升高。這種相關(guān)呈連續(xù)性，即使妊娠期血糖輕度升高，同樣會(huì)對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生不利影響［11］。綜上，本研究結(jié)果表明高脂飲食聯(lián)合中等劑量STZ誘導(dǎo)GDM大鼠模型，造模成功率高、死亡率低。