胡興，陳霞，顏一丹，欒曉瑾，于駿

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

通常認為睪丸生殖細胞腫瘤可能與生殖干細胞自我更新和分化障礙相關(guān)，但具體機制尚不清楚。果蠅睪丸的精子發(fā)生過程與哺乳動物睪丸的生精過程相似，而其干細胞微環(huán)境結(jié)構(gòu)清晰，可模擬人類正常睪丸生殖干細胞的自我更新和分化過程以及生殖細胞腫瘤的形成過程。

在果蠅睪丸中，早期生殖細胞的自我更新和分化過程嚴格地受到細胞內(nèi)源性信號和細胞外信號的共同調(diào)控［1-3］。研究表明，中心細胞可分別通過生殖干細胞和體細胞干細胞的膜受體激活JAK-STAT信號通路，從而調(diào)控這兩類干細胞的自我更新能力［4-5］。值得注意的是，生殖干細胞可分化為包囊細胞，并為生殖細胞提供生長和發(fā)育的微環(huán)境。有證據(jù)表明，在干細胞微環(huán)境中，包括中心細胞和生殖干細胞在內(nèi)的體細胞可分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）樣細胞因子DPP和GBB蛋白，并通過生殖干細胞的膜受體TKV蛋白激活BMP信號通路，從而抑制分化因子BAM蛋白的表達，進而保持生殖干細胞自我更新的能力［6-8］。在分化的精原細胞中，由于脫離了與中心細胞和生殖干細胞的接觸，DPP和GBB蛋白不能激活BMP信號通路，BAM蛋白的表達顯著上調(diào)，生殖干細胞啟動分化過程。

目前，果蠅睪丸生殖干細胞的調(diào)控機制依然很不清楚，亟需進一步探索其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以便闡明人非梗阻性無精子癥和睪丸生殖細胞腫瘤的發(fā)生機制。我們前期的研究通過果蠅UAS-Gal4系統(tǒng)進行大規(guī)模的RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅篩選，鑒定到多個參與生殖干細胞自我更新的調(diào)控因子［9］。本研究探討CG5033基因在果蠅睪丸干細胞微環(huán)境中影響生殖干細胞自我更新和分化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

UAS-RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅購自清華果蠅中心，源自TRiPRNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫（Transgenic RNAi Project）。Gal4轉(zhuǎn)基因果蠅品系信息：nos-Gal4（BDSC，#4937），tj-Gal4（DGRC，#104055）。bam-Gal4轉(zhuǎn)基因果蠅品系由陳大華實驗室（中科院動物所）贈送。W1118品系果蠅作為野生型（WT）果蠅使用，來源于清華果蠅中心。

保種果蠅和實驗用果蠅均在溫度25℃、相對濕度60%的條件下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

BSA（生工生物工程公司），免疫熒光兔Vasa一抗（1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology公司），免疫熒光小鼠眼缺陷蛋白（eyes absent，Eya）一抗（標記成熟的包囊細胞，1∶20）、DE-cad（標記中心細胞和包囊細胞）、1B1一抗（1∶75，DSHB公司），免疫熒光大鼠鋅指結(jié)構(gòu)域1蛋白（Zfh1）一抗（1∶5 000，用于標記體細胞干細胞，浙江大學(xué)佟超實驗組贈予）。免疫熒光488-兔二抗、cy3-小鼠二抗、647-大鼠二抗（美國 Molecular Probes and Jackson Immunologicals公司），Hoechst33342（美國 Invitrogen公司），激光共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss Lsm710）。

1.3 果蠅雜交策略

分別挑選nos-Gal4、bam-Gal4及tj-Gal4品系的雄性果蠅，與UAS-CG5033 RNAi品系的處女果蠅進行雜交。在F1代中挑選特定基因型（nos＞CG5033 RNAi、bam＞CG5033 RNAi及 tj＞CG5033 RNAi）果蠅用于后續(xù)實驗。nos＞CG5033 RNAi、bam＞CG5033 RNAi和tj＞CG5033 RNAi基因型指的是分別在生殖干細胞、分化的精原細胞和包囊細胞中敲減CG5033基因。

1.4 生育率測試

在F1代果蠅中挑選單只特定基因型（Gal4＞CG5033 RNAi）的成年雄蠅與3只野生型（W1118）處女蠅雜交，觀察其是否可以獲得后代果蠅。通過統(tǒng)計F1代單只雄性果蠅生育比例判斷雄性果蠅生育能力。4組F1代成年雄性果蠅樣本數(shù)：野生型組124只，nos＞CG5033 RNAi組 91只，tj＞CG5033 RNAi組85只，bam＞CG5033 RNAi組82只。

1.5 野生型和nos＞CG5033 RNAi雄性果蠅睪丸形態(tài)觀察

將經(jīng)CO2處理后處于暈厥狀態(tài)的野生型和nos＞CG5033 RNAi雄性果蠅置于盛有1×PBS的解剖皿中，用解剖鑷拉出果蠅睪丸，分離周圍組織。將睪丸在1×PBS中清洗數(shù)遍，然后直接置于蓋玻片上，通過光學(xué)顯微鏡觀察果蠅睪丸整體結(jié)構(gòu)。

1.6 野生型和nos＞CG5033 RNAi果蠅睪丸相對長度測量

根據(jù)文獻［9］中的方法，通過Image J 1.48軟件測量睪丸頭部到尾部的最大距離作為果蠅睪丸長度。nos＞CG5033 RNAi果蠅組睪丸長度為野生型果蠅組睪丸長度的50%～75%稱為小睪丸，微小睪丸是指干預(yù)組果蠅睪丸長度小于野生型組睪丸長度的50%。

1.7 免疫熒光染色

取特定基因型果蠅睪丸，用4%多聚甲醛固定20 min后，用含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）的PBS清洗3次，每次10 min，5%的BSA封閉30 min，加入兔 Vasa、小鼠 Eya、DE-cad、Zfh1一抗于4℃冰箱孵育過夜后再用含0.1%TritonX-100的PBS清洗3遍，除去未結(jié)合的一抗，再用相應(yīng)的二抗［488-兔抗體、cy3-小鼠抗體、647-大鼠抗體（1∶1 000）］在室溫孵育1 h，最后用含0.1%TritonX-100的PBS清洗，去除多余的二抗，將睪丸置于普通載玻片，用30 μL 1.0 mg／mL的 Hoechst33342染 DNA 5 min，加入20μL 80%甘油，蓋上蓋玻片封片。通過共聚焦激光顯微鏡采集果蠅睪丸免疫熒光圖片。

2 結(jié)果

2.1 敲減不同細胞CG5033基因?qū)π坌怨壣芰Φ挠绊?/h3>

生育率測試結(jié)果表明，與野生型組比較，敲減精原干細胞中CG5033基因（nos＞CG5033 RNAi組）可導(dǎo)致雄性完全不育（χ2＝210.95，P＜0.01），而敲減包囊細胞中CG5033基因（tj＞CG5033 RNAi組）也可顯著降低雄性果蠅的生育能力（χ2＝143.02，P＜0.01）。bam＞CG5033 RNAi組與野生型雄性果蠅組生育率間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.88，P＞0.05）。見表1。

表1 敲減CG5033基因的雄性果蠅生育率測試結(jié)果

2.2 在精原干細胞中敲減CG5033基因?qū)е挛⑿〔G丸和生殖細胞消失

在光學(xué)顯微鏡下，野生型組均未出現(xiàn)微小睪丸，而nos＞CG5033 RNAi組睪丸的形態(tài)明顯異常，微小睪丸比例達97.65%（83／85）。見圖 1。

圖1 兩種雄性果蠅睪丸形態(tài)（光鏡）

免疫熒光結(jié)果顯示，與野生型組睪丸比較，nos＞CG5033 RNAi果蠅睪丸中的生殖干細胞完全消失（中心細胞周圍一圈細胞Vasa陰性），剩余的生殖細胞也幾乎完全消失；睪丸出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)性塌陷，充滿代償性增生的包囊細胞（圖2）。上述結(jié)果表明，CG5033基因可能調(diào)控了果蠅睪丸生殖細胞的自我更新過程。

圖2 在早期生殖細胞中敲減CG5033基因?qū)е律臣毎毕?/p>

2.3 敲減包囊細胞中CG5033基因?qū)е虏G丸生殖細胞腫瘤形成

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與野生型果蠅睪丸比較，敲減包囊細胞CG5033基因的雄性果蠅睪丸中出現(xiàn)異常的生殖細胞團塊（圖3）；在tj＞CG5033 RNAi睪丸的生殖細胞團中，1B1完全呈現(xiàn)點狀分布（圖4）。在tj＞CG5033 RNAi睪丸中，Zfh 1和 Eya蛋白均未見表達（圖5），表明果蠅生殖細胞腫瘤的存活不依賴包囊細胞。

圖3 果蠅睪丸生殖細胞腫瘤的表型（免疫熒光染色）

圖4 融合體在生殖細胞腫瘤中的表達模式分析（免疫熒光染色）

圖5 兩組果蠅睪丸中Zfh 1和Eya蛋白的表達（免疫熒光染色）

統(tǒng)計結(jié)果表明，tj＞CG5033 RNAi組睪丸中存在異常生殖細胞團塊的睪丸比例達到了86.36%（57／66），這也可能是引起雄性生育功能障礙的重要原因。以上結(jié)果表明，睪丸中積累的生殖細胞團塊為早期未分化的生殖細胞，并且可不依賴包囊細胞提供的微環(huán)境進行生長。

2.4 敲低精原細胞中CG5033基因不影響生殖細胞的自我更新過程

免疫熒光染色表明，bam＞CG5033 RNAi組睪丸中存在生殖細胞、包囊細胞和中心細胞，其結(jié)構(gòu)未見明顯異常（圖6）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，bam＞CG5033 RNAi組正常形態(tài)睪丸比例為 98.51%（66／67），與野生型組間無明顯差異［100%（78／78）］。

圖6 敲減精原細胞中CG5033基因不影響生殖細胞的存活

3 討論

后生動物的組織形態(tài)以及細胞的維持和再生都依賴于干細胞發(fā)揮作用。果蠅睪丸中存在兩種干細胞類型，一類是生殖干細胞，另一類稱之為體細胞干細胞，兩者對生殖干細胞的自我更新和分化都具有至關(guān)重要的作用［10］。然而，這兩種干細胞的自我更新和分化能力可被一類從上皮細胞分化而來的體細胞所維持，這類體細胞被稱為中心細胞［11］。這3類細胞組成了果蠅睪丸干細胞微環(huán)境［12］。生殖干細胞對果蠅的精子發(fā)生過程以及生育能力至關(guān)重要。目前，干細胞微環(huán)境細胞的自主性調(diào)控和非自主性調(diào)控也是果蠅睪丸發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

為了探究CG5033基因與雄性生育能力的相關(guān)性，本實驗運用3個不同細胞類型中表達的Gal4來驅(qū)動UAS-CG5033 RNAi。nos-Gal4主要在生殖干細胞和精原細胞中表達，并在生精過程后期大幅下調(diào)［13］，而bam-Gal4的表達主要局限在2細胞-16細胞的精原細胞中表達［13-15］。tj-GAL4是體細胞表達的Gal4，主要在包囊細胞中表達。這些Gal4除了表達模式的不同，它們的表達時間和表達水平也具有顯著的差異性。Vasa、Eya和DE-cad是果蠅睪丸中常用的抗體，可以在睪丸中標記不同類型的細胞。通過這些標記可觀察到果蠅睪丸生殖細胞、包囊細胞以及干細胞微環(huán)境的結(jié)構(gòu)。值得一提的是，在干細胞微環(huán)境中，中心細胞四周被生殖干細胞（Vasa抗體陽性）和體細胞干細胞（Vasa抗體陰性）包繞。

本研究結(jié)果提示，CG5033基因在生殖干細胞微環(huán)境中扮演了非常重要的角色。首先，CG5033基因可在生殖干細胞中自主性調(diào)控其自我更新能力。在前期的研究中，通過UAS-Gal4系統(tǒng)實現(xiàn)的大規(guī)模RNAi篩選實驗，我們鑒定到一系列參與調(diào)控生殖干細胞自我更新的關(guān)鍵蛋白，CG5033基因也是其中一個重要的調(diào)控因子。其次，本研究結(jié)果顯示CG5033基因還可利用生殖干細胞的非自主性調(diào)控發(fā)揮作用，主要是通過體細胞干細胞來促進生殖干細胞的分化過程。有研究報道，體細胞干細胞對生殖干細胞的正常分化過程具有重要的調(diào)控作用，體細胞干細胞缺陷可以介導(dǎo)生殖細胞的分化阻滯，并導(dǎo)致生殖細胞腫瘤的形成［9，16］。而成熟的包囊細胞缺陷主要影響生殖細胞的維持異常［17］。因此，本實驗通過tj-Gal4驅(qū)動UAS-CG5033 RNAi介導(dǎo)產(chǎn)生了果蠅睪丸生殖細胞團塊的表型。根據(jù)我們前期研究推測，這些異常的生殖細胞團塊可能是分化過程受阻的生殖干細胞樣團塊，最終可發(fā)展為生殖細胞腫瘤。為了證實這個推測，我們運用1B1抗體觀察CG5033基因在這些生殖細胞團塊中的表達模式。實驗結(jié)果證實，這些生殖細胞團塊的表型確實是體細胞干細胞影響生殖干細胞的分化過程而導(dǎo)致的。第三，雖然本研究顯示CG5033基因主要在睪丸干細胞微環(huán)境中發(fā)揮作用，但在前期研究中證實了干細胞微環(huán)境調(diào)控因子可在精原細胞中影響生殖細胞的分化過程，并導(dǎo)致生殖細胞腫瘤形成［9］。本研究利用bam-Gal4驅(qū)動UAS-CG5033 RNAi發(fā)現(xiàn)睪丸結(jié)構(gòu)并沒有明顯異常，說明精原細胞中CG5033并不影響生殖細胞的分化過程。

Flybase數(shù)據(jù)庫分析顯示，CG5033基因編碼的蛋白包含了WD40重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合核糖體蛋白復(fù)合體。Demontis等［18］的研究顯示，CG5033基因可作為dMyc蛋白轉(zhuǎn)錄的報告蛋白，參與Foxo信號通路的調(diào)控。多個蛋白復(fù)合體組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同參與了干細胞微環(huán)境的調(diào)控。蛋白合成和降解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在干細胞微環(huán)境中可能都參與調(diào)節(jié)生殖干細胞自我更新和分化［10］。有研究表明，Mei-P26和BAM蛋白在果蠅睪丸中調(diào)控早期精原細胞由增殖向分化轉(zhuǎn)變的過程［19-21］。因此，Mei-P26和BAM蛋白也是蛋白翻譯機器的重要調(diào)控分子。我們推測，Mei-P26和BAM蛋白可能是CG5844的下游調(diào)控蛋白。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CG5033是一個新的干細胞微環(huán)境調(diào)控因子，可在果蠅睪丸干細胞微環(huán)境中通過自主性調(diào)控直接影響生殖干細胞的自我更新能力。更重要的是，該基因還可通過體細胞干細胞影響生殖干細胞的分化，最終導(dǎo)致生殖細胞腫瘤的形成。本研究為理解人非梗阻性無精子癥和睪丸生殖細胞腫瘤的致病機制提供了實驗基礎(chǔ)。