楊會肖 呂胡玲 陳慧姍 吳紅崑
根齲是老年人群中常見的口腔疾患,據(jù)第三次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國65~74歲的老年人群中根齲的患病率高達(dá)63.6%[1]。根齲進(jìn)展迅速,治療不及時(shí)常常會累及牙髓或根尖周組織,造成疼痛,甚至失牙,嚴(yán)重危害老年人的口腔及全身健康,降低生活質(zhì)量[2]。目前公認(rèn)的齲病致病機(jī)制為口腔菌群失衡學(xué)說[3-4],該學(xué)說認(rèn)為:某些口腔微生物產(chǎn)酸引起牙面環(huán)境酸化,口腔微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變,產(chǎn)酸或耐酸菌的定植增加,引起牙齒表面脫礦與再礦化過程發(fā)生失衡,導(dǎo)致牙體硬組織崩解和牙本質(zhì)的有機(jī)基質(zhì)暴露;同時(shí),酸環(huán)境還可以活化機(jī)體內(nèi)的蛋白酶導(dǎo)致暴露的牙本質(zhì)基質(zhì)不斷發(fā)生降解??谇晃⑸锞旱南嗷プ饔霉餐龠M(jìn)了齲病的發(fā)生及發(fā)展。
目前,已知人類口腔中存在的細(xì)菌約700種[5],其中超過一半是用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)無法培養(yǎng)的。Preza等[6]利用克隆測序的方法對根齲牙菌斑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),除了變異鏈球菌、乳酸桿菌及放線菌外,糞腸球菌、阿托波菌、歐陸森氏菌、擬溶半乳桿菌、Pseudoramibacter alactolyticus,以及丙酸桿菌屬和月形單胞菌屬的個(gè)別細(xì)菌株均與根齲的發(fā)生密切相關(guān),揭示了根齲相關(guān)細(xì)菌的復(fù)雜性和多樣性;但其他研究卻得出了不同的結(jié)論[7-8],因此,有必要對根齲相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步的探討。
唾液是口腔內(nèi)細(xì)菌的天然載體,是形成牙菌斑的外部環(huán)境。已有的研究表明,唾液中微生物的種類決定了牙面上菌群的定植模式[9],罹患牙周病或齲病的人群,其唾液微生物群落與健康人存在顯著差異[10];同時(shí)唾液微生物群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,唾液取樣簡單,無痛,具有無創(chuàng)性,因此,常常被用于口腔微生物多樣性的研究[11]。但目前這些研究多集中于兒童或中年人,且主要針對冠部齲,目前,尚未見到有關(guān)根齲與唾液微生物群落組成關(guān)系的研究。
區(qū)別于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法,以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)的高通量方法如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),可以不必對原始樣本進(jìn)行培養(yǎng)而直接提取基因組DNA,分析細(xì)菌群體在基因水平和代謝水平上的多樣性,監(jiān)測微生物群落的動態(tài)變化,以及發(fā)現(xiàn)新的口腔微生物物種等[12]。本研究采用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)初步探討不同根齲狀況的老年人唾液微生物群落的多樣性變化,尋找根齲相關(guān)優(yōu)勢菌群,期望為老年人根齲的預(yù)測及防治提供一定理論依據(jù)。
1.1臨床材料 隨機(jī)抽樣總體為參加2012年5月~2013年7月度四川大學(xué)華西醫(yī)院全身體格檢查的65歲以上老年人,年齡65~92歲。實(shí)驗(yàn)分為2組:根齲組:根齲牙面數(shù)(Root caries surface,RDS)≥1,n=10;健康對照組:n=10。根齲的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]為:齲損質(zhì)軟或皮革感,齲損位于根面上或釉牙本質(zhì)界處但大部分位于根面上,包括原發(fā)齲和繼發(fā)齲??偧{入標(biāo)準(zhǔn):全身健康狀況良好,精神狀況正常,無長期服藥史,未罹患糖尿病、高血壓、舍格倫綜合癥等系統(tǒng)性疾病,未接受頭頸部術(shù)后放化療等,采樣前2個(gè)月未服用抗生素,抗菌漱口液及免疫抑制劑,口腔衛(wèi)生較好,牙齦健康,除根齲外,無其他明顯口腔感染性疾病如牙周病、牙髓炎、口腔黏膜疾病及腫瘤等,剩余牙數(shù)大于18顆,無長烤瓷橋修復(fù)。
1.2樣本采集 經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn),研究對象或其監(jiān)護(hù)人在取樣前均簽署知情同意書。由同一名操作者于上午8時(shí)左右分別收集2組人群非刺激性全唾液2~3mL,取樣前均禁水禁食,自然口含唾液數(shù)分鐘后讓唾液自行流入無菌EP管中,-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 DNA的提取和PCR擴(kuò)增 將唾液樣本在室溫下化凍,離心,收集細(xì)菌沉淀。使用Master PureTMDNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies公司,美國)提取唾液樣本中細(xì)菌全基因DNA作為模板。選用通用引物Bac1和Bac2對細(xì)菌的16Sr RNA基因V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,其中Bac1引物5′端連接40bp的“GC夾”,序列如下。Bac1:5′-CGCCCG CCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCG CCC GAC TAC GTC CCA GCA GCC-3′,Bac2:5′-GGA CTA CCA GGGTAT CTA ATCC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為300bp。2%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
1.4變性梯度凝膠電泳 (DGGE)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過DCodeTMUniversal Mutation檢測系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳[12]。聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%(w/v),變性劑濃度梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%~70%。電壓恒定條件下,在1×TAE緩沖液(pH 8.5)中電泳16h。電泳完成后,溴化乙錠的染色,后于凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)采集DGGE凝膠的數(shù)碼圖像。
1.5 DGGE凝膠圖像分析 采用Quantity One1-D分析軟件4.6.2(Bio-Rad公司,美國)對電泳圖像進(jìn)行分析。DGGE圖譜進(jìn)行優(yōu)化處理后,識別、調(diào)整泳道及條帶,進(jìn)行條帶配對,并對圖譜中的條帶進(jìn)行半定量分析,采用豐富度(S)和Shannon-Wieners指數(shù)(H’)反應(yīng)群落的多樣性。使用非加權(quán)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)進(jìn)行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.6切膠回收及序列測定 選擇特征性條帶進(jìn)行切膠回收,回收產(chǎn)物以Bac1/Bac2通用引物進(jìn)行再富集,擴(kuò)增產(chǎn)物送大連TaKaRa生物公司進(jìn)行克隆、測序。測序結(jié)果于人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(HOMD,http://www.homd.org),美國國立生物信息中心(NCBI,http://ncbi.nlm.nih.gov)和RDPⅡ數(shù)據(jù)庫(Ribosomal database project,http://rdp.cme.msu.edu)中進(jìn)行BLAST檢索比較,一致性達(dá)到98%-100%的序列被認(rèn)為具有陽性指示意義。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件,采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間豐富度(S)及Shannon-Wieners指數(shù)(H’)差異,顯著性水檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P< 0.05。
2.1 DGGE圖譜總體特征 根齲與無齲組老年人群唾液微生物群落的DGGE圖譜見圖1,每個(gè)電泳條帶代表1個(gè)樣本,同一位置水平的條帶代表1種細(xì)菌的基因型。實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性,Sorensons相似系數(shù)為0.87。兩組人群唾液細(xì)菌的組成具有多樣性和個(gè)體差異性,圖譜表現(xiàn)為未見到完全相同的泳道出現(xiàn)。
圖1 唾液菌群的PCR-DGGE圖譜
3.2條帶類型分析 共發(fā)現(xiàn)34個(gè)不同類型的條帶(圖2,Band type1-34),各泳道條帶數(shù)介于16~28之間,平均條帶數(shù)為19.85±2.56。其中有9個(gè)條帶(Band type 1,3,13,16,20,21,22,23,24)在約80%以上樣品中都有出現(xiàn),其中Band type3,13,16,21的檢出率為100%,推測它們可能是老年人群口腔常駐菌群;6個(gè)條帶在兩組的分布有顯著差異,其中band type 5,27,32在健康組的絕大多數(shù)樣本里均能檢出(檢出率,5(90%),27(90%),32(80%)),而在根齲組檢出減少(檢出率,5(50%),27(40%),32(40%))。Band type 25在根齲組的檢出率為100%,在健康組僅檢出2例(檢出率,20%);而band14,34在根齲檢出率均達(dá)到80%,在健康組的檢出頻率則下降至30%,甚至更低(檢出率,14(30%),34(20%))。這6個(gè)條帶分別對應(yīng)圖1中A,B,C,E,D,F,切膠回收后進(jìn)行克隆測序。
圖2 條帶類型分析圖
2.3多樣性分析 采用豐富度(S)和Shannon-Weaver指數(shù)(H’)來分析2組人群的多樣性。物種豐富度(species richness,S)是指群落所包含的物種數(shù)目,表明群落或微生態(tài)環(huán)境中物種數(shù)目的多寡[14]。本實(shí)驗(yàn)中豐富度以泳道中所有條帶數(shù)目表示。H’的計(jì)算是基于DGGE凝膠條帶的位置和條帶的強(qiáng)度(圖3),計(jì)算公式為H′=∑piln(pi),(pi=ni/N),其中ni為單個(gè)條帶的光密度,N為所有條帶的光密度[14]。老年無齲組唾液細(xì)菌的豐富度SNRC為20.90±2.92,而根齲組老年人唾液細(xì)菌的平均條帶數(shù)SRC為18.80±1.69,但兩組豐富度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(SNRC:SRC,P=0.103);根齲組和無齲組老年人唾液菌群的Shannon-Wieners指數(shù)(H’)則分別為2.52±0.17和2.73±0.1,兩者之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖3 DGGE圖譜各條帶相對強(qiáng)度的數(shù)字化示意圖
3.4 UPGMA分析 UPGMA聚類分析結(jié)果(圖4)表明,除泳道16和19外,健康組內(nèi)大部分樣本(泳道 18,14,12,20,11,15,17,13)聚類到鄰近位置,Dice’s相似系數(shù)為0.61;而根齲組除了泳道1和7外,大部分樣本,(泳道2-6,8,9,10)亦聚類到鄰近的不同位置,兩組人群唾液微生物群落結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出較高內(nèi)部相似性。
圖4 UPGAM系統(tǒng)發(fā)育樹
3.5條帶回切測序結(jié)果 A-F每個(gè)條帶選取2個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序,得到了種屬、甚至株級別的微生物信息,測序匹配度高達(dá)98%以上(表1)。異發(fā)酵乳桿菌DSM5705(Lactobacillusmalefermentans strain DSM 5705)、未獲培養(yǎng)的真細(xì)菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(Uncultured Eubacterium sp clone IS017B74/IS013B55)及頰纖毛菌C-1013-b(Leptotrichia buccalis C-1013-b)在根齲組檢出率高于正常組;而副流感嗜血桿菌T3T1(Haemophilus parainfluenzae T3T1),奈瑟菌屬11-26360(Neisseria sp.11-26360)和某種未獲培養(yǎng)的細(xì)菌(Uncultured bacterium clone ncd2240d01c1)在正常組檢出較頻率更高。
表1 回切條帶測序比對結(jié)果
根面齲是老年口腔疾患中最常見、危害較大的疾病之一,它具有廣泛的流行性,臨床損害的特殊性及防治的復(fù)雜性,需要特別注意。口腔微生物菌群與宿主的相互作用同口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),以群落和微生物生態(tài)為基礎(chǔ)對口腔微生物菌群進(jìn)行探討不僅為理解根齲的病因?qū)W提供了新的視角,也為根齲的防治提供了新的手段。
本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對根齲及口腔健康老年人唾液微生物群落進(jìn)行總體分析,DGGE指紋圖譜共獲得34種不同位置的條帶,直觀地顯示了不同個(gè)體唾液微生物的組成具有多樣性及差異性。DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn),老年根齲組的口腔微生物豐富度較老年健康組有減少的趨勢(組SRC=18.80±2.94;SNRC=20.90±2.51),但差異不明顯;而老年根齲患者唾液菌群的另一多樣性指數(shù)-Shannon-Wieners指數(shù)(H’)(H’RC=2.52±0.17;H’NRC=2.73±0.18)則顯著小于正常者。因?yàn)镾hannon指數(shù)除了包括種數(shù)外,還包括各種間個(gè)體分配的均勻性(equability或evenness)。各種之間,個(gè)體分配越均勻,H’值就越大。如果每一個(gè)體都屬于不同的種,多樣性指數(shù)就最大;如果每一個(gè)體都屬于同一種,則其多樣性指數(shù)就最小,因此與豐富度的簡便直觀相比,Shannon指數(shù)更能真實(shí)地反映多樣性,因此,我們認(rèn)為老年根齲患者唾液微生物菌落多樣性減少。根齲組唾液細(xì)菌的多樣性較正常組有減少的趨勢,這與Li等[15]的研究結(jié)果一致。而條帶類型分析則發(fā)現(xiàn),6個(gè)條帶(band type 5,27,32,25,14,34)在兩組人群唾液中均可檢出,但檢出頻率差異較大。這些發(fā)現(xiàn)都再次驗(yàn)證了齲病的口腔菌群生態(tài)失衡學(xué)說,即齲病的發(fā)生并不是由于某種致病菌的出現(xiàn)或者整個(gè)口腔微生物數(shù)量增多導(dǎo)致,而是隨著口腔微生態(tài)環(huán)境的改變,導(dǎo)致一部分細(xì)菌的生長繁殖被抑制,數(shù)量減少或消失,而另一部分細(xì)菌則大量繁殖,轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件致病菌,從而導(dǎo)致齲齒的發(fā)生[16]。
結(jié)合特征條帶測序結(jié)果,研究發(fā)現(xiàn),頰纖毛菌C-1013-b(band type25)可以在老年根齲組唾液樣本中100%被檢出,這與Ling等[17]針對兒童齲病患者唾液菌群的研究一致。已知頰纖毛菌可以與韋榮菌及變鏈菌發(fā)生共聚,作為它們黏附于牙面的支架[18]。但Preza等則發(fā)現(xiàn)在健康根面菌斑中纖毛菌的檢出比例更高[11]。但頰纖毛菌C-1013-b是可以培養(yǎng)的,因此使得對它的理化性能及其與根齲的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步探討成為可能。已知真細(xì)菌包含較多種類,有學(xué)者指出Eubacterium saburreum可以與Veillonella spp.發(fā)生共聚幫助其黏附到牙面上導(dǎo)致齲病的發(fā)生[19],但也有研究指出Eubactrium.saburreum clone GT038,Eubacterium sp.clone EI074,Eubacterium sp.clone DO016等與口腔健康密切相關(guān)[20],提示我們不同的細(xì)菌株可能具有完全不同的生物特性,因此,有必要從基因型水平對微生物的毒力因子進(jìn)行探討。本研究發(fā)現(xiàn),某種未獲培養(yǎng)的真細(xì)菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(band type 34)在根齲組樣本中的檢出率高于健康人群,這與Preza等所得出的結(jié)論一致[11],同時(shí)這些種屬級別,甚至株級別微生物信息的獲得,也證實(shí)了DGGE在研究微生物多樣性方面的實(shí)用性。另外,本研究首次發(fā)現(xiàn)了唾液中異發(fā)酵乳桿菌DSM 5705(band type 14)在根齲組唾液中的檢出率亦遠(yuǎn)高于健康組。異發(fā)酵乳桿菌可以代謝葡萄糖等生成乳酸,且產(chǎn)酸能力較發(fā)酵乳桿菌更強(qiáng)[21],其最適pH值范圍為4.1-6.9,但目前其與根齲發(fā)生的關(guān)系尚未見報(bào)道。除此之外,本試驗(yàn)也證實(shí)了副流感嗜血桿菌T3T1(band type5)和奈瑟菌sp.11-26360(band type 32)與健康的口腔狀況關(guān)系密切[21,8,10]。由于唾液微生物菌群結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定性及唾液取樣無創(chuàng)方便的優(yōu)勢,因此唾液微生物常常被作為口腔疾病檢測的分子生物學(xué)標(biāo)記。本文發(fā)現(xiàn)有6個(gè)菌株在兩組人群中的分布存在明顯差異,或許可以為根齲的唾液檢測提供一定的理論依據(jù)。
根據(jù)聚類分析的結(jié)果,我們無法將根齲及健康老年人唾液微生物分成2個(gè)截然不同的群落,可能與本研究樣本量有關(guān),或例外樣品的存在有關(guān)。由于宿主的選擇作用,唾液微生物群落本身就具有個(gè)體獨(dú)特性[22]。但是,本文發(fā)現(xiàn)健康老年人唾液微生物相似性(Dicer系數(shù)為0.61)高于根齲組,提示可能有穩(wěn)定的唾液微生物菌群存在,它們對于維持老年人口腔健康十分重要。因此老年人應(yīng)定期進(jìn)行口腔檢查及口腔衛(wèi)生保健,維護(hù)良好的口腔生態(tài)平衡,保持口腔健康。