任大勇 朱劍威 劉宏妍 于寒松

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

近年來，由金黃色葡萄球菌污染魚、肉、乳制品等食品而造成的食源性危害日益嚴(yán)重。這與部分金黃色葡萄球菌對抗生素產(chǎn)生了耐藥基因，以及菌株分泌的耐熱腸毒素在一般化學(xué)殺菌劑和高溫殺菌處理時(shí)并不能有效地去除有一定關(guān)系[1-3]。化學(xué)殺菌劑和高溫殺菌方式在去除大部分有害成分的同時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致食品品質(zhì)下降，所以開發(fā)天然抗菌物質(zhì)便成為了研究的熱點(diǎn)。

而乳酸菌作為一種益生菌，代謝分泌的酸、過氧化氫和抗菌肽等分泌物通常被認(rèn)為是安全無害的(generally regarded as safe，GRAS)而被廣泛地研究[4]。本課題組在前期試驗(yàn)[5-7]中，從中國東北家庭自制的辣醬、臭豆腐、黏面子等發(fā)酵食品中篩選出了7株可以分泌抗菌肽，并對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等具有抑菌效果的乳酸菌，且大部分菌株分泌的抗菌肽具有耐高溫、耐酸可以溶于部分有機(jī)試劑等特點(diǎn)[8]。

目前，通常使用過硫酸銨等化學(xué)試劑從天然微生物中提取抗菌肽[9-10]，但是需要考慮抗菌肽的含量和結(jié)構(gòu)差異，需要選擇合適的分離純化方法，所需成本較高。而Meng等[11]通過畢赤酵母載體成功表達(dá)了具有抑菌效果的抗菌肽，與天然微生物中提取抗菌肽相比則更具有成本低和表達(dá)量大等優(yōu)勢[12-13]。但由于畢赤酵母具有發(fā)酵時(shí)間長的缺點(diǎn)，馬淑霞等[14]通過pET32表達(dá)載體成功表達(dá)對革蘭氏陰性菌具有良好抑制效果的片球菌素PediocinPA-1，通過大腸桿菌表達(dá)載體對抗菌肽進(jìn)行克隆與表達(dá)，更具有培養(yǎng)周期短、成本低的特點(diǎn)。pET28a與pET32同屬大腸桿菌表達(dá)載體，且pET28a兩端含有2個(gè)組氨酸標(biāo)記，更易于表達(dá)產(chǎn)物的純化[15]。所以本研究擬以乳酸菌為原料，通過PCR擴(kuò)增獲得抗菌肽基因，將其與pET28a質(zhì)粒進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)菌株中，以獲得產(chǎn)抗菌肽的基因工程菌株，為抗菌肽的克隆表達(dá)途徑的拓寬和具體抗菌肽對致病菌抑菌效果的鑒定提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

辣醬、臭豆腐、黏面子、湯子面：東北地區(qū)農(nóng)家腌制；

人體病變組織： ATCC菌種庫；

Pfu酶：北京天根生化科技有限公司；

dNTP、DL500 DNA marker、DL15000 DNA marker：寶生物工程有限公司；

Nco I、Xho I、BamH I限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶：美國NEB公司；

膠回收試劑盒：美國Omega公司；

質(zhì)粒提取試劑盒：愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；

瓊脂糖：西班牙Biowest公司；

BL21(DE3)感受態(tài)：北京全式金生物有限公司；

Ni柱：上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；

Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)：北京索萊寶科技有限公司；

硫酸卡那霉素：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；

pET28a-DH5α菌株：武漢淼靈生物科技有限公司；

金黃色葡萄球菌(ATCC 6538p)：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

植物乳桿菌(L2, T4, T8, L16)、戊糖乳桿菌(L19, S6)、副干酪乳桿菌(H9)：由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品毒理與安全實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

PCR儀：GeneAmp PCR System 9700型，美國ABI公司；

電泳儀：DYY-11型，北京六一儀器廠；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92-II型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株信息與活化 通過傳統(tǒng)牛津杯擴(kuò)散抑菌試驗(yàn)篩選出具有抑菌效果的植物乳桿菌(L2, T4, T8, L16)、戊糖乳桿菌(L19, S6)和副干酪乳桿菌(H9)并在MRS中純化2次后備用。pET28a-DH5α菌株、金黃色葡萄球菌分別接種于LB培養(yǎng)基內(nèi)37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜復(fù)蘇后備用。菌株信息及培養(yǎng)條件見表1。

表1 菌株信息Table 1 Strains information

1.2.2 抗菌肽基因的擴(kuò)增與回收 以7株菌株為模板，根據(jù)Nation Center for Biotechnology Information(NCBI)中抗菌肽基因序列設(shè)計(jì)引物(表2)。PCR反應(yīng)條件：100 μL反應(yīng)體系中分別添加濃度為10 μmol/L的上下游引物和樣品各2 μL，Pfu酶0.5 μL，10 μL的10×E Pfu Buffer，8 μL dNTP Mixture，超純水補(bǔ)足，并按照如下程序：95 ℃預(yù)變性2 min；35個(gè)循環(huán)(95 ℃ 變性30 s；退火45 s；68 ℃延伸90 s)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在2%瓊脂糖中進(jìn)行電泳驗(yàn)證并進(jìn)行DNA純化后于-20 ℃保存。進(jìn)一步在引物兩端添加有保護(hù)性堿基，Nco I、Xho I酶切位點(diǎn)和去除終止密碼子的引物按照上述條件以保存的DNA片段為樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和回收。同時(shí)用質(zhì)粒提取試劑盒對過夜培養(yǎng)的pET28a-DH5α菌株進(jìn)行提取。

表2 乳酸菌抗菌肽基因的PCR引物信息?Table 2 PCR primer information of antimicrobial peptide gene form lactic acid bacteria

? 當(dāng)引物添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基后，退火溫度可適當(dāng)增加5～10 ℃。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證 質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖1所示，提取的pET28a質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物使用Nco I和Xho I進(jìn)行酶切和膠回收處理，按照10 μL反應(yīng)體系在16 ℃下過夜連接后轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)中振蕩復(fù)蘇1 h，涂布于含50 μg/mL 硫酸卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取正常生長的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并將其送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對。

圖1 pET28a-抗菌肽的重組表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖

Figure 1 Construction flow chart of recombinant expression vector of pET28a-antibacterial peptide

1.2.4 抗菌肽蛋白的表達(dá)與鑒定 將經(jīng)驗(yàn)證的陽性轉(zhuǎn)化子，按照1%接入100 mL 含有硫酸卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，待OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h 后4 000 r/min離心10 min，收集菌體進(jìn)行破壁處理(pH 7.2的PBS緩沖液重懸菌體，400 W超聲4 s，間歇5 s至菌體破碎)。收集胞內(nèi)蛋白并用8 mol/L尿素進(jìn)行變性處理，透析復(fù)性和Ni柱純化等處理。純化蛋白采用牛津杯擴(kuò)散法對金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌測試，同時(shí)以氨芐青霉素(50 μg/mL)和水為對照。選取具有抑菌效果的純化蛋白經(jīng)Tricine-SDS-PAGE[16]分析，并將目的條帶送蘇州普泰生物技術(shù)有限公司進(jìn)行nanoLC-ESI-MS/MS測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增抗菌肽基因

由圖2可知，7株菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后在150～200 bp出現(xiàn)明顯的目的條帶，再進(jìn)一步添加相應(yīng)酶切位點(diǎn)引物對菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序后，結(jié)果在NCBI中BLAST對比后發(fā)現(xiàn)，目的序列與相應(yīng)的PlnF、PlnE等都具有100%的同源性，表明PCR擴(kuò)增中堿基未發(fā)生突變等現(xiàn)象。這與先前報(bào)道[17-19]乳桿菌中含有PlnF、PlnE、PlnE、PlnF等抗菌肽基因相一致。此外，還有研究者[20]在乳酸菌中發(fā)現(xiàn)enterocinA、pediocinPA-1等具有抑制金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌的小分子、熱穩(wěn)定的多肽基因，為乳酸菌中抗菌肽基因的擴(kuò)增提供了理論依據(jù)。

2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

在LB平板上隨機(jī)挑選陽性轉(zhuǎn)化子以含酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果顯示，在200 bp附近大部分陽性轉(zhuǎn)化子有清晰的條帶(圖3)，進(jìn)一步通過測序比對結(jié)果表明相應(yīng)的重組質(zhì)粒已正確轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21(DE3)中。

2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)與抗菌活性

IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后破碎收集的各胞內(nèi)蛋白經(jīng)Ni柱純化后對金黃色葡萄球菌均無任何抑菌效果。進(jìn)一步將胞內(nèi)蛋白通過尿素變性，透析復(fù)性和純化等處理后，經(jīng)牛津杯擴(kuò)散法，以氨芐青霉素(50 μg/mL)和T8為對照發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理后的PlnF蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌圈增至(13.43±0.21) mm，與未經(jīng)Ni柱純化的蛋白相比抑菌效果顯著增強(qiáng)[圖4(e)]，而PlnK的純化蛋白在牛津杯內(nèi)有較為微弱的抑制金黃色葡萄球菌能力[圖4(b)]，此外PlnJ、 PlnN、PlnE蛋白對金黃色葡萄球菌均無任何抑菌活性。Fangqiang等[21]曾將Pln1基因克隆入pET32a中，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的蛋白具有耐酸等特性，并且對革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌效果。在pET28a克隆表達(dá)的PlnE、PlnJ等抗菌肽基因，但可能由于抗菌肽分子量在3～7 kDa，僅具有蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以可能在外源表達(dá)過程中折疊或者螺旋出現(xiàn)錯(cuò)誤或者降解[22-23]；以及單純抗菌肽在pET28a中是以包涵體形式表達(dá)，此外在使用變性劑在變復(fù)性的過程中[24]，也可能造成抗菌肽失去了活力；并且各個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子之間出現(xiàn)一定表現(xiàn)差異，蛋白表達(dá)的含量也不完全一樣。所以將進(jìn)一步探索密碼子優(yōu)化，融合表達(dá)等途徑使抗菌肽在胞外或者是以可融性的形式進(jìn)行克隆表達(dá)。綜合表達(dá)蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌能力，進(jìn)一步使用Tricine-SDS-PAGE和nanoLC-ESI-MS/MS分析對目的蛋白進(jìn)行鑒定。

C. 空白對照組 M. DL Marker 圖2 7株菌株中不同抗菌肽基因的PCR擴(kuò)增

Figure 2 PCR amplification results of different antimicrobial peptide genes of 7 strains

1～12泳道. 隨機(jī)挑選的陽性轉(zhuǎn)化子編號(hào) C. 空白對照組 M. DL Marker 圖3 5種pET28a-抗菌肽的陽性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證Figure 3 Validation of 5 positivetransformants of pET28a-antimicrobial peptides

1. 氨芐青霉素 2. 未純化的復(fù)性蛋白 3. T8上清液 4. 水 5. 純化蛋白

圖4 各表達(dá)蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

Figure 4 Inhibitory effect of various expressed proteins onStaphylococcusaureus

2.4 PlnF的Tricine-SDS-PAGE和質(zhì)譜分析

純化的目的蛋白經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳后，如圖5所示，蛋白在7.8 kDa附近出現(xiàn)明顯的單一條帶。與已知的PlnF的蛋白(約為5.9 kDa)相比，在電泳圖上顯示的蛋白分子量略大一點(diǎn)，可能是組氨酸等極性氨基酸的存在，造成可見條帶與預(yù)測大小有一定的偏差。通過nanoLC-ESI-MS/MS分析，并與Uniprot數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果表明，目的片段與PlnF抗菌肽具有97.6%的同源性。

1～7道分別為水對照、50 mmol/L咪唑洗脫的PlnF蛋白、100 mmol/L 咪唑洗脫的PlnF蛋白、200 mmol/L咪唑洗脫的PlnF蛋白、空白對照、pET28a-PlnF胞內(nèi)蛋白、pET28a胞內(nèi)蛋白

圖5 純化蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳圖

Figure 5 Purification ofTricine-SDS-PAGE protein electrophoresis

3 結(jié)論

從辣醬、臭豆腐、黏面子、湯子面中通過傳統(tǒng)抑菌試驗(yàn)篩選出的具有抑菌效果的7株菌株，經(jīng)PCR擴(kuò)增證明以T4、T8為主的幾株菌株中含有PlnF、PlnE等抗菌肽基因。進(jìn)一步在抗菌肽基因兩端添加Nco I和Xho I后與pET28a質(zhì)粒一起在37 ℃進(jìn)行酶切和DNA回收，在T4連接酶作用下連接過夜后轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，經(jīng)0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h，細(xì)胞破碎，變復(fù)性和Ni柱純化后，pET28a-PlnF的蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(13.43±0.21) mm。但是抗菌肽的原始基因在pET28a中以包涵體形式存在，所以在下一步的研究中將進(jìn)一步通過密碼子優(yōu)化或融合表達(dá)等方式促使抗菌肽基因以胞外分泌的方式在原核大腸桿菌表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)。