衛(wèi)陽(yáng)飛 宋 海 岳國(guó)仁 張宏曦 李彩霞，3

(1. 河西學(xué)院甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000；2. 甘州區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局， 甘肅 張掖 734000；3. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000)

葡萄籽是葡萄酒生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物。隨著中國(guó)葡萄酒行業(yè)的發(fā)展，每年產(chǎn)生的葡萄籽下腳料達(dá)數(shù)萬噸[1]。研究表明，葡萄籽含有豐富的蛋白質(zhì)、葡萄籽油、原花青素和多種維生素[2]，除了具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗輻射[5]、保護(hù)心肌[6]等藥理活性。因此，近年來如何就葡萄籽這種資源性副產(chǎn)物進(jìn)行開發(fā)利用引起了廣泛關(guān)注。目前有關(guān)葡萄籽油和原花青素的研究較為常見，而葡萄籽蛋白質(zhì)雖營(yíng)養(yǎng)和生物活性價(jià)值已為人們所認(rèn)識(shí)，但對(duì)其化學(xué)組成研究卻相對(duì)較少，缺乏相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，在葡萄籽內(nèi)以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)2種形式存在。由于大多數(shù)氨基酸的極性強(qiáng)、揮發(fā)性低、無強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)，造成其分離和檢測(cè)比較困難[7]。目前常用的檢測(cè)方法為氨基酸分析儀[8-9]和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[10-11]。前者操作簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高，而HPLC因其儀器較為常見、衍生試劑多樣等特點(diǎn)，近年來亦得到廣泛應(yīng)用。現(xiàn)有文獻(xiàn)[12-14]多采用氨基酸分析儀對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)中水解氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，而采用HPLC同時(shí)分析葡萄籽中水解氨基酸和游離氨基酸組成的研究還未見報(bào)道。

故為了更好地利用葡萄籽資源，充分實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)再利用，本研究擬以6種常見釀酒葡萄籽為原料，采用衍生化高效液相色譜法對(duì)其所含水解氨基酸和游離氨基酸成分進(jìn)行分析，為葡萄籽的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葡萄籽：黑皮諾、雷司令購(gòu)自甘肅皇臺(tái)酒業(yè)股份有限公司(武威)，蛇龍珠、賽美容購(gòu)自甘肅祁連葡萄酒有限責(zé)任公司(蘭州)，赤霞珠、貴人香購(gòu)自甘肅紫軒酒業(yè)有限公司(嘉峪關(guān))，其中黑皮諾、蛇龍珠和赤霞珠為紅葡萄酒釀酒品種(紅籽)，而雷司令、賽美容和貴人香為白葡萄酒釀酒品種(白籽)，粉碎后過60目篩備用；

17種氨基酸混合對(duì)照溶液：包括天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、胱氨酸，濃度均為2.5 μmol/mL，日本和光純藥工業(yè)有限公司；

17種氨基酸的單體對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；

異硫氰酸苯酯：純度≥98%，阿拉丁試劑有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所；

超純水：自制。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國(guó)安捷倫公司；

超聲波清洗儀：KQ250B型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子分析天平：AUW120D型，日本島津公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

超純水儀：Nex Power 1000型，韓國(guó)HUMAN公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

(1) 水解氨基酸樣品溶液：取不同葡萄籽樣品0.1 g，精密稱定，置于水解管中，加入6.0 mol/mL鹽酸15 mL，密封后于110 ℃水解24 h，抽濾，取濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮揮發(fā)去鹽酸，用0.02 mol/L鹽酸定容至100 mL。以不加樣品的溶液為空白對(duì)照。

(2) 游離氨基酸樣品溶液：取不同葡萄籽樣品1.0 g，精密稱定，加入20 mL水，浸泡2 h，60 ℃、250 W超聲提取1 h，抽濾，取濾液冷凍干燥成粉，加水定容至10 mL備用。以不加樣品的溶液為空白對(duì)照。

(3) 混合對(duì)照溶液：將濃度為2.5 μmol/mL的氨基酸混合對(duì)照溶液用0.02 mol/L鹽酸依次稀釋，制備成各氨基酸濃度均為1.250 0，0.625 0，0.125 0，0.062 5，0.012 5 μmol/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 衍生化方法的優(yōu)化 取混合對(duì)照溶液和供試品溶液各200 μL，分別加入0.1 mol/mL異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1.0 mol/mL三乙胺乙腈溶液100 μL，混勻，室溫反應(yīng)一定時(shí)間(0.5，1.0，1.5 h)，再分別加入正己烷400 μL，劇烈振搖以除去多余的衍生試劑及副產(chǎn)物，重復(fù)此步驟(1，2，3次)，合并下層溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用?？疾煅苌磻?yīng)時(shí)間和正己烷加入次數(shù)對(duì)氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響。

1.2.3 高效液相色譜條件的優(yōu)化 Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：稱取15.2 g無水乙酸鈉，加水1 850 mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH(5.5，6.0，6.5，7.0)，再加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾；流動(dòng)相B：甲醇-乙腈-水(體積比20∶60∶20)，梯度洗脫(0～5 min，100% A～98% A；5～6 min，98% A～95% A；6～14 min，95% A～91% A；14～18 min，91% A～79% A；18～32 min，79% A～55% A；32～34 min，55% A～45% A；34～38 min，45% A～0% A；38～42 min，0% A～0% A；42～45 min，0% A～100% A；45～50 min，100% A～100% A)；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。考察色譜流動(dòng)相緩沖液pH對(duì)分離效果的影響。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

(1) 專屬性考察：在“1.2.3”優(yōu)化好的色譜條件下進(jìn)樣分析水解氨基酸和游離氨基酸樣品溶液(均以雷司令為例)、空白溶液和17種氨基酸的混合對(duì)照品溶液的衍生化產(chǎn)物。

(2) 線性關(guān)系考察：分別精密吸取衍生化后的不同濃度混標(biāo)溶液10 μL，按“1.2.3”優(yōu)化好的色譜條件測(cè)定不同濃度下各氨基酸的峰面積，以摩爾濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

(3) 重復(fù)性考察：按照“1.2.1”和“1.2.2”項(xiàng)下優(yōu)化后的方法，制備5份雷司令水解氨基酸和5份游離氨基酸供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下優(yōu)化后色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算不同樣品中氨基酸峰面積的RSD。

(4) 穩(wěn)定性考察：分別取制備好的同一份雷司令水解氨基酸和游離氨基酸供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下優(yōu)化后色譜條件，分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算不同時(shí)間測(cè)定氨基酸峰面積的RSD。

(5) 加標(biāo)回收試驗(yàn)：取5份已知含量的同一份雷司令樣品0.1 g，精密稱定，分別加入濃度為2.5 μmol/mL的氨基酸混合對(duì)照品溶液1.0 mL；取5份已知含量的同一份雷司令樣品1.0 g，精密稱定，分別加入濃度為2.5 μmol/mL的氨基酸混合對(duì)照品溶液0.5 mL；均按照“1.2.1”和“1.2.2”項(xiàng)下優(yōu)化后方法制備供試液，按照“1.2.3”項(xiàng)下優(yōu)化后色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)測(cè)得量與加入量計(jì)算各水解氨基酸和游離氨基酸的回收率及RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化及色譜條件的優(yōu)化

目前氨基酸的柱前衍生檢測(cè)常用的衍生試劑包括鄰苯二甲醛(O-Phthaldiadehyde，OPA)、異硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate，PITC)、丹磺酰氯(1-Dimethylaminonaphtha-lene-5-sulphonylchloride，Dansyl-Cl)等，其中PITC能夠與一級(jí)和二級(jí)氨基酸同時(shí)反應(yīng)生成苯氨基硫甲酰衍生物，具有衍生反應(yīng)速度快[15]，靈敏度較高，衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，故本研究采用PITC作為氨基酸的柱前衍生試劑。如圖1、2所示，當(dāng)衍生反應(yīng)時(shí)間超過1.0 h時(shí)，HPLC檢測(cè)氨基酸峰面積無明顯增加，而正己烷加入2次后再增加次數(shù)色譜圖中衍生物試劑雜峰未見減少。故最終選擇衍生化反應(yīng)時(shí)間為1.0 h，正己烷加入次數(shù)為2次。該結(jié)果與郭俊國(guó)等[16]關(guān)于氨基酸衍生化反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)論吻合。

如圖3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基酸的測(cè)定受pH影響較大，保持其他條件不變，只有當(dāng)pH為6.5時(shí)才可實(shí)現(xiàn)17種氨基酸的分離。pH會(huì)直接影響氨基酸衍生物的保留時(shí)間和峰形[17]，導(dǎo)致分離困難，推測(cè)可能與pH會(huì)影響氨基酸與PITC反應(yīng)生成的苯氨基硫甲酰衍生物存在形式及其與色譜柱之間相互作用有關(guān)。

圖1 衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)氨基酸衍生物測(cè)定的影響

Figure 1 Effect of the reaction time on the determination of derivatives of amino acids by HPLC

圖2 正己烷加入次數(shù)對(duì)氨基酸衍生物測(cè)定的影響

Figure 2 Effect of n-hexane addition times on the determination of derivatives of amino acids by HPLC

圖3 pH對(duì)氨基酸衍生物測(cè)定的影響Figure 3 Effect of pH on the determination of derivatives of amino acids by HPLC

2.2 方法的專屬性和線性關(guān)系考察

由圖4可知，17種氨基酸在37 min內(nèi)達(dá)到完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)和衍生化試劑不干擾氨基酸的測(cè)定。線性考察結(jié)果見表1，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0～0.999 8。該結(jié)果與黃蘊(yùn)芝等[18]將氨基酸經(jīng)陽(yáng)離子交換樹脂富集后，采用Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-水(體積比4∶1)為流動(dòng)相A，30 mmol/L乙酸鈉-乙腈(體積比355∶15)為流動(dòng)相B的色譜條件取得的分離效果近似。王菲菲等[19]選用Waters ACQUITY UPLC H-Class-PDA超高效液相色譜系統(tǒng)以及AccQ-TagTMUltra(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱，在衍生化試劑相同情況下，將色譜分析時(shí)間縮短至10 min，提高了分析效率，值得在以后的研究中借鑒。

2.3 重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收試驗(yàn)

結(jié)果表明，同法處理的5份樣品中不同水解氨基酸峰面積的RSD為0.67%～3.15%，不同游離氨基酸峰面積的RSD為0.93%～4.43%，表明該方法的重復(fù)性良好。同一個(gè)樣品不同時(shí)間測(cè)定的水解氨基酸峰面積的RSD為0.54%～2.44%，游離氨基酸峰面積的RSD為0.76%～3.45%，表明該法處理所得供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表2，水解氨基酸的平均回收率為92.0%～104.6%，RSD為0.83%～4.07%，游離氨基酸的平均回收率為95.2%～102.4%，RSD為1.06%～3.98%。水解氨基酸的平均回收率范圍略大于游離氨基酸的，可能與水解氨基酸的酸水解步驟相關(guān)。

1. 天冬氨酸 2. 谷氨酸 3. 絲氨酸 4. 甘氨酸 5. 組氨酸 6. 精氨酸 7. 蘇氨酸 8. 丙氨酸 9. 脯氨酸 10. 酪氨酸 11. 纈氨酸 12. 甲硫氨酸 13. 賴氨酸 14. 異亮氨酸 15. 亮氨酸 16. 苯丙氨酸 17. 胱氨酸 A. 雷司令游離氨基酸樣品 B. 雷司令水解氨基酸樣品 C. 空白對(duì)照 D. 17種氨基酸混合對(duì)照品

圖4 各樣品色譜圖 Figure 4 HPLC chromatograms of different samples表1 不同氨基酸的線性方程、檢測(cè)限和定量限Table 1 Linear regression, LODs and LOQs of different references

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery tests (n=5) %

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果與分析

取衍生好的不同葡萄籽樣品溶液，按照“1.2.3”優(yōu)化后色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3和圖5。結(jié)果表明，不同品種葡萄籽中水解氨基酸均以谷氨酸、脯氨酸為主，其次是甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸和亮氨酸。游離氨基酸以精氨酸、脯氨酸和谷氨酸為主。6種葡萄籽中水解氨基酸的總含量為130.46～163.24 mg/g，游離氨基酸的總含量為2.04～5.13 mg/g，白籽中游離氨基酸含量普遍高于紅籽，而紅籽中水解氨基酸含量普遍高于白籽。

不同葡萄籽水解氨基酸樣品中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的22.37%～25.16%，必需氨基酸/非必需氨基酸為33.09%～38.41%，紅籽和白籽差別不大。而游離氨基酸樣品中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的9.28%～39.95%，必需氨基酸/非必需氨基酸為15.31%～92.12%，白籽所含游離氨基酸中必需氨基酸比例明顯高于紅籽。

FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)為：人體必需氨基酸含量/氨基酸總含量在40%左右，人體必需氨基酸含量/非必需氨基酸含量在60%左右[20]。從這一角度分析，葡萄籽蛋白質(zhì)具有一定的蛋白補(bǔ)充功能。

2.5 葡萄籽中人體必須氨基酸比例與FAO/WHO理想氨基酸構(gòu)成模式的比較

如表4所示，不同葡萄籽中蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸基本符合FAO/WHO理想氨基酸構(gòu)成比例。

? *為必須氨基酸；**為兒童成長(zhǎng)必須氨基酸。

表4 不同葡萄籽中必須氨基酸模式比例比較表Table 4 The comparativeTable of pattern scales of hydrolyzed amino acids in different grape seeds %

圖5 不同葡萄籽中各氨基酸含量分布圖Figure 5 The content distribution of amino acids in different grape seeds

3 結(jié)論

本研究建立了柱前衍生結(jié)合高效液相色譜測(cè)定葡萄籽中17種水解氨基酸和游離氨基酸含量的方法，該方法穩(wěn)定，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。葡萄籽中氨基酸含量豐富，6種葡萄籽中水解氨基酸的總含量為130.46～163.24 mg/g，游離氨基酸的總含量為2.04～5.13 mg/g。不同葡萄籽水解氨基酸樣品中必需氨基酸含量占氨基酸總量的22.37%～25.16%，必需氨基酸/非必需氨基酸為33.09%～38.41%，蘇氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸基本符合FAO/WHO理想氨基酸構(gòu)成比例，表明葡萄籽蛋白質(zhì)具有一定的蛋白補(bǔ)充功能。白籽中所含游離氨基酸含量普遍高于紅籽，而紅籽中水解氨基酸含量普遍高于白籽，推測(cè)從氨基酸角度出發(fā)，如果葡萄籽食用方法為打粉服食應(yīng)選擇紅籽，而如果泡水飲用最好選擇白籽類產(chǎn)品。本試驗(yàn)只選擇了17種氨基酸作為研究對(duì)象，但在實(shí)際測(cè)定葡萄籽中水解和游離氨基酸的過程中，發(fā)現(xiàn)還有一些其他的氨基酸成分未得到檢測(cè)，需要后續(xù)進(jìn)行HPLC-MS鑒定或更多的標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)才能夠得以證實(shí)。