胡欣穎 賀稚非 李洪軍

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

隨著食品行業(yè)的發(fā)展，食品分析技術的作用日趨重要。應用化學分析方法，如原子吸收光譜法(atomic absorption spectroscopy，AAS)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)以及各種聯(lián)用方法如氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等，檢測食品中有毒有害物質(zhì)，但前處理過程繁雜、需要專業(yè)操作人員、分析步驟繁瑣、設備昂貴[1-2]，并且受限于實驗室使用，無法在食品生產(chǎn)與流通過程中實現(xiàn)有毒有害物質(zhì)的實時檢測。最主要的是這些技術雖然能檢測化合物濃度，但不能反映有關樣品的毒性[3]。生物學檢測方法不僅可以估計樣本毒性，還可以估計毒物對整個生態(tài)系統(tǒng)的綜合影響[4]。經(jīng)典生物測定通常使用小鼠、魚類、藻類、甲殼類動物、植物或其他生物體[5]，但也存在缺點：需要特殊設備和專業(yè)操作人員，測定時間長、重現(xiàn)性低以及存在生物標準化爭議[5-7]。因此尋找一種簡單、快速且便宜的生物檢測方法成為迫切的需求。

發(fā)光細菌是一類在正常代謝過程會發(fā)光的生物。自1969年Kossler闡述了基于生物發(fā)光細菌的生物測定法后[8]，發(fā)光細菌逐漸被用于各種環(huán)境污染物監(jiān)測和食品單一及綜合毒性評價。同時構(gòu)建了以發(fā)光細菌發(fā)光強度變化為指標的有害物質(zhì)檢測標準，相關的檢測試劑盒也陸續(xù)研制成功[9]。相較于化學檢測，發(fā)光細菌檢測具有前處理簡單，反應快、靈敏度高、可實時監(jiān)測，成本低、樣品需求量少、實驗室及耗材需求低等優(yōu)點[10-11]，將成為食品安全檢測新的發(fā)展方向，目前中國關于發(fā)光細菌檢測的研究相對較少，缺乏對發(fā)光細菌在毒性評估和食品有毒有害物質(zhì)檢測方面的系統(tǒng)性分析和總結(jié)。

基于此，本文綜述發(fā)光細菌在毒性評估及食品安全檢測中的應用，對發(fā)光細菌檢測存在的問題及未來的發(fā)展方向進行分析和總結(jié)，以期對發(fā)光細菌在食品有毒有害物質(zhì)檢測中的應用和新型檢測儀器的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 發(fā)光細菌檢測有毒有害物質(zhì)的機理

1.1 發(fā)光細菌簡介

生物發(fā)光是一種常見的現(xiàn)象，絕大多數(shù)生物發(fā)光有機體生活在海洋中，只有少數(shù)生活在陸地或淡水環(huán)境中。發(fā)光細菌是一類能夠在正常代謝過程中發(fā)出藍綠色光的生物，全部是革蘭氏陰性菌，其大多為直桿菌，也有少數(shù)呈弧狀或球桿狀，有鞭毛。發(fā)光細菌個體微小，長度約為1.5～3.0 μm，寬度約為0.5～0.8 μm，釋放的藍綠色熒光波長范圍為450～490 nm[12]。單個發(fā)光細菌發(fā)出的光極其微弱，肉眼幾乎不可見，但當大量發(fā)光細菌聚集在一起時，發(fā)出的光則肉眼可見。

發(fā)光細菌屬于變形菌門、γ變形菌綱。發(fā)光細菌可分為4個屬：光桿菌屬(Phototrhabdus)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和弧菌屬(Vibrio)[12-13]。光桿菌屬的典型菌有陸地發(fā)光桿菌(P.luminescens)、溫和光桿菌(P.temperate)等，發(fā)光桿菌屬的典型菌有明亮發(fā)光桿菌(P.phosphoreum)、鰒魚發(fā)光桿菌(P.leiognathi)、夾孢發(fā)光桿菌(P.angustum)等，希瓦氏菌屬的典型菌有羽田希瓦氏菌(S.hanedai)等，弧菌屬的典型菌有哈維氏弧菌(V.harveyi)、費氏弧菌(V.fischeri)、青?；【?V.qinghaiensis)、霍亂弧菌(V.cholerae)等。

1.2 發(fā)光細菌檢測機理

發(fā)光細菌中分子氧以還原態(tài)的黃素單核苷酸(FMNH2)及長鏈脂肪醛(RCHO)為底物，經(jīng)胞內(nèi)細菌熒光酶催化作用，將二者分別氧化為黃素核苷酸(FMN)和長鏈脂肪酸，同時伴隨著波長為450～490 nm藍綠光的釋放，可以通過生物發(fā)光計檢測。

在發(fā)光細菌中廣泛存在表達熒光素基因(lux)。lux基因主要包括luxC、luxD、luxA、luxB、luxE 5個部分，其中l(wèi)uxA、luxB編碼熒光素酶[14]，該酶是一種分子量為80 kDa的異二聚體蛋白，包括α(40～42 kDa)和β(36～37.5 kDa)2個亞基[15]，在其發(fā)光過程對FMNH2具有高度的特異性。luxC、luxD、luxE分別編碼?；鞍走€原酶(R，54 kDa)、?；D(zhuǎn)移酶(t，33 kDa)和依賴ATP的合成酶(S，42 kDa)，這3種酶能夠組成脂肪酸還原酶復合體催化醛類(該反應中參與發(fā)光的醛可能是十四醛)生成，使細菌持續(xù)發(fā)光[16]。海洋發(fā)光細菌，如明亮發(fā)光桿菌(P.phosphoreum)、鰒魚發(fā)光桿菌(P.leiognathi)、哈維氏菌(V.harveyi)、費氏弧菌(V.fischeri)等，在luxE之后還有一個額外的基因luxG，有研究者[17]推測luxG基因產(chǎn)物是為螢光素酶反應提供FMNH-底物的黃素還原酶。發(fā)光細菌生物發(fā)光機理見圖1[9]。

圖1 發(fā)光細菌生物發(fā)光機理Figure 1 Luminescent bacteria bioluminescence mechanism

發(fā)光細菌檢測機理分為特異性檢測和非特異性檢測，特異性發(fā)光細菌檢測是根據(jù)受體-報告基因的原理(“l(fā)ights on”模式)[18]，在lux上游導入特殊應激啟動子，當宿主細胞的生長環(huán)境中有毒物存在時，毒物進入到宿主細胞，誘導特異性調(diào)控元件，進而調(diào)控下游基因表達，發(fā)出光源。非特異性檢測利用的原理是發(fā)光細菌“l(fā)ights off”模式[19-20]，即外來毒物通過直接抑制發(fā)光細菌酶的活性以及抑制細胞內(nèi)有關發(fā)光反應的生理代謝對發(fā)光細菌形成發(fā)光抑制作用，見圖2[19]。在“l(fā)ights on”測定中，可定量的報道分子與已知的被測目標毒物活化的特定基因啟動子融合，改變發(fā)光強度。在“l(fā)ights off”測定中，樣品毒性根據(jù)正常細胞活性的抑制程度估算，這種抑制可以發(fā)生在反應的任何階段或影響細胞生長發(fā)育的任何位點。生物發(fā)光廣泛依賴于細胞代謝，需要高能輔因子，因此，當接觸到外界有毒有害物質(zhì)時，發(fā)光細菌新陳代謝受到影響，進而使發(fā)光強度減小[21-22]。

圖2 發(fā)光細菌檢測有害物質(zhì)原理Figure 2 The principle of detecting harmful substances by luminescent bacteria

2 發(fā)光細菌在毒性評估中的研究現(xiàn)狀

2.1 利用發(fā)光細菌檢測與傳統(tǒng)急性毒性檢測方法對比

生物毒性是指外源性物質(zhì)與機體接觸或進入機體后對機體產(chǎn)生的損傷，有急性毒性和慢性毒性2種。在應用發(fā)光細菌對毒物進行生物毒性評價時，發(fā)光細菌因在毒物中暴露時間較短，通常被認為是一種急性毒性評估。急性毒性的測試是毒理學安全性評價的基礎性試驗，是制訂衛(wèi)生管理標準不可或缺的依據(jù)[23]。隨著急性毒性評價方法的不斷發(fā)展，當前中國的急性毒性試驗主要采用傳統(tǒng)方法(GB 15193. 3—2003)[24]。但由于使用動物數(shù)量較大且LD50的測試受動物及實驗室環(huán)境的影響，在“3Rs”原則，即減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)、替代(replacement)[25]下，衍生出了固定劑量法(fixed dose procedure，F(xiàn)DP)、急性毒性分類法(acute toxic class method，ATC)、上下法(up-and-down procedure，UDP)等方法，旨在采取其他措施來減少試驗中動物的痛苦，這3種方法是目前常用的方法。其與利用發(fā)光細菌檢測相比優(yōu)缺點見表1[10,21,26-27]。

表1 急性毒性評估中傳統(tǒng)方法和發(fā)光細菌檢測方法的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of traditional methods and luminescent bacteria detection methods in acute toxicity assessment

2.2 發(fā)光細菌在毒性評估中的應用

細菌發(fā)光在毒理學中的應用從發(fā)光細菌應用于生態(tài)監(jiān)測開始，目前仍被廣泛地應用，關于發(fā)光菌在毒性評估中的研究與應用主要集中在環(huán)境科學的各個領域[28-29]。在食品行業(yè)，可見報道主要集中在發(fā)光細菌用于食品添加劑、農(nóng)藥和獸藥的毒性評價。Cai等[30]研究了5種典型的農(nóng)藥(樂果、馬拉硫磷、阿特拉津、滅草靈、乙草胺)對發(fā)光細菌的毒性作用及其作用機制。石穎等[31]分別用8種獸藥作用于青?；【鶴67，發(fā)現(xiàn)Q67的相對發(fā)光率與獸藥濃度呈反比，并總結(jié)了8種獸藥的抑制效率。

這些研究多集中在對單一物質(zhì)的毒性評價，但在實際的檢測應用中，食品成分具有復雜性，化學混合物的毒性具有聯(lián)合作用，如拮抗作用、協(xié)同作用或加和效應等，發(fā)光細菌會受多種有毒物質(zhì)的影響。因此，研究混合毒物對發(fā)光細菌的毒性作用具有重要的意義?；诖?，吳淑杭[32]以青海弧菌、費氏弧菌和明亮發(fā)光桿菌T3為受試對象，研究重金屬、農(nóng)藥和獸藥等農(nóng)產(chǎn)品污染物的單一毒性和聯(lián)合毒性，揭示多種污染物共存時產(chǎn)生的毒性聯(lián)合作用與綜合生物毒性，并建立專用數(shù)學模型。

在聯(lián)合毒性的研究中，選擇合適的聯(lián)合毒性評價模型進行毒性評價非常重要，常用的聯(lián)合毒性評價方法有指數(shù)法、濃度加和與獨立作用模型(CA/IA)法以及定量結(jié)構(gòu)-活性關系模型(QSAR模型)預測法[33-34]。3種毒性評價方法各有優(yōu)劣，在應用過程中應根據(jù)實際情況進行選擇。目前關于這些模型在發(fā)光細菌中的應用也有諸多報道，張瑾等[35]以青?；【鶴67為受試微生物，測定6種吡啶類離子溶液組成的4組二元混合物和2組三元混合物的聯(lián)合毒性，用濃度加和模型進行分析，結(jié)果表明：除了有一組主要是拮抗作用外，其他組都是加和作用。董玉瑛等[36]測定了3種醫(yī)藥成分：阿奇霉素、鹽酸環(huán)丙沙星和阿司匹林組成的混合體系對發(fā)光細菌的聯(lián)合毒性，應用多種方法進行評價，得出的結(jié)果具有一致性，說明這些評價方法在聯(lián)合毒性中具有可行性。

3 發(fā)光細菌在食品安全檢測中的應用

3.1 發(fā)光細菌應用現(xiàn)狀

表2顯示了國內(nèi)外學者利用發(fā)光細菌在部分食品安全檢測中的應用。由表2可知，目前國內(nèi)外的研究重點主要集中在以天然發(fā)光細菌為代表的非特異性發(fā)光細菌的應用上。在食品原料選擇上，以農(nóng)畜產(chǎn)品居多，比如蔬菜、肉類、奶類，很少涉及其他食品種類。而且在農(nóng)畜產(chǎn)品中以畜產(chǎn)品為原料的研究最多，在檢測毒物種類上，主要集中在對農(nóng)獸藥，尤其是對獸藥進行檢測，而對食品添加劑、食品中的生物毒素以及其他有毒有害物質(zhì)的檢測較少，并且在獸藥檢測中，很少涉及一些激素類獸藥如糖皮質(zhì)激素等的檢測研究。

在發(fā)光細菌的選擇方面，以青海弧菌為代表的淡水發(fā)光細菌逐漸成為研究的熱門。因為與海洋發(fā)光細菌相比，青海弧菌在檢測時不需要保證2%～3%的氯化鈉濃度，避免了NaCl對樣品特性的干擾。

在特異性發(fā)光細菌研究應用方面，目前在食品科學領域的研究報道較少，大多集中在四環(huán)素類抗生素以及少量關于β-內(nèi)酰胺類藥物的研究上。盡管特異性工程細菌在食品科學領域的研究應用剛剛起步，但其在環(huán)境科學中已有深入研究，已經(jīng)建立了對多種重金屬能夠特異性檢測的工程菌[46]。這些研究可以為發(fā)光細菌在食品安全檢測中的應用提供借鑒。

3.2 檢測效果的影響因素

發(fā)光細菌是一種生物檢測技術，發(fā)光細菌本身具有不確定性，且樣品的組成具有復雜性。因此在實際檢測過程中，檢測效果會受到多種因素的影響，如原料前處理、毒物興奮效應、樣品刺激作用等。

3.2.1 原料前處理 在食品安全檢測中，樣品前處理占據(jù)整個樣品分析的大部分時間，并且檢測結(jié)果的重復性、準確性以及方法的靈敏度都與樣品前處理過程密切相關。理想的原料預處理方法，不僅能獲得待檢測物質(zhì)，還能夠減少對發(fā)光細菌檢測的干擾。目前，在樣品前處理中常用的方法有溶劑萃取法和離心法。在國內(nèi)外的一些研究中，都是將原料絞碎、離心，然后取上清液備用[41,47-48]，但這些方法均存在提取不徹底的缺點，這使發(fā)光細菌檢測技術不能準確地反映被檢樣品的毒性。并且在用有機溶劑萃取時，有機溶劑也可能會對發(fā)光細菌發(fā)光強度造成影響。因此，Pellinen等[40]在檢測魚肉中四環(huán)素時，對處理魚肉樣品的方法進行了優(yōu)化，在均質(zhì)之后不進行離心，也不使用有機溶劑，優(yōu)化后的方案可使四環(huán)素的檢出限更低。

表2 國內(nèi)外學者在食品安全檢測中應用發(fā)光細菌的部分研究Table 2 The application of luminescent bacteria in food safety detection

在利用發(fā)光細菌進行快速檢測時，無色或顏色較淺的液體樣品比較容易測試，而固體樣品則必須經(jīng)過前期處理才能進行檢測。在固體樣品的預處理方面，一些適用于其他生物檢測的預處理方法如固相萃取[49]等，也適用于發(fā)光細菌檢測。

3.2.2 毒物興奮效應 毒物興奮效應(Hormesis)是一種生物體的適應性反應，它是指在致毒因素不同的劑量強度范圍，生物體具有不同的劑量—反應關系[50]。Hormesis通常被認為是毒物對生物體在高劑量時表現(xiàn)負面影響(如生長發(fā)育受到抑制)，但在低劑量時卻表現(xiàn)為有益作用(如刺激生長發(fā)育)[51]，其主要應用于遺傳毒性致癌物健康風險評估與毒物生態(tài)風險評估上。大多數(shù)農(nóng)、獸藥都顯示出毒物興奮效應，Calabrese等[51]指出青霉素、鏈霉素、土霉素、氯霉素、硫藤黃菌素、抗金葡美蘇、磺胺、桿菌肽、吡啶硫胺素等藥物在低劑量下能夠刺激生物體生長；Morse[52]認為需要考慮農(nóng)藥的Hormesis，從而完整了解農(nóng)藥的潛在影響。

在發(fā)光細菌毒性評估中，也會出現(xiàn)毒物興奮效應。湯淼等[53]以費氏弧菌作為受試生物，鹽酸四環(huán)素作為研究對象，證明了在細菌生長的延滯期和平臺期，鹽酸四環(huán)素對費氏弧菌的發(fā)光強度存在時間依賴型毒物興奮效應。Shen等[54]通過建立劑量—效應曲線和時間—效應曲線研究了Cu、Zn、Cd、Cr對青?；【挠绊懀l(fā)現(xiàn)4種金屬對青?；【哂忻黠@的毒物興奮效應。

3.2.3 樣品刺激作用 在利用發(fā)光細菌進行毒性評估和食品安全檢測時，樣品中的某些非研究對象也會引起發(fā)光細菌發(fā)光強度的變化。已有的研究表明，低劑量的K+、Ca2+、Na+等無機離子均對天然發(fā)光細菌產(chǎn)生刺激作用[53]，并且這種刺激作用在淡水重組菌中并未出現(xiàn)減弱現(xiàn)象[55]。

樣品的刺激作用具有兩面性，在海洋發(fā)光細菌利用過程中，需要2%～3%的NaCl溶液來模仿海洋環(huán)境，并用其處理樣品，溶液中的KCl、NaCl等無機物會對發(fā)光細菌產(chǎn)生刺激作用，在毒性測試中使發(fā)光細菌保持最大發(fā)光強度。但是這種鹽溶液有可能會改變樣品性質(zhì)，如降低金屬的生物利用率和有機物的溶解性[56]，這都會使檢測誤差偏大。

4 結(jié)論與展望

發(fā)光細菌繁殖速度快，易于培養(yǎng)和觀察，這為其在檢測中的應用提供了一個廣闊的發(fā)展空間。發(fā)光細菌檢測方便快捷且成本低，雖然在環(huán)境科學領域已經(jīng)取得長足的發(fā)展，但在食品科學領域，尤其是在食品安全檢測中的研究與應用起步較晚，其前期研究主要停留在整體水平以及細胞水平，目前正向基因水平和分子水平的方向縱深發(fā)展。因此，在食品領域，對發(fā)光細菌展望如下：

(1) 發(fā)光細菌在食品安全檢測中的應用研究范圍需要擴大，不應僅僅停留在農(nóng)畜產(chǎn)品檢測方面，應拓寬至其他深加工食品中；并且被檢測物質(zhì)應包含農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、食品添加劑以及生物毒素等有毒有害物質(zhì)，全方位地確保食品安全。

(2) 在諸多限制發(fā)光細菌檢測發(fā)展的因素中，原料前處理方式、毒物興奮效應以及樣品自身的刺激作用是制約該方法發(fā)展的主要因素，應尋求合理的解決方式減少這些影響。

(3) 在特異性發(fā)光細菌研究方面，應積極借鑒其他領域的成功經(jīng)驗，構(gòu)建出在食品有毒有害物質(zhì)檢測中能實現(xiàn)特異性檢測的發(fā)光細菌。

(4) 在熱門發(fā)光細菌青海弧菌的研究方面，應對發(fā)光機理及毒物興奮效應進行系統(tǒng)研究，從而為其在食品安全檢測中的應用提供理論依據(jù)。

(5) 制定關于發(fā)光細菌在食品行業(yè)使用的統(tǒng)一標準，現(xiàn)在可作為參考的只有GB/T 15441—1995，發(fā)光細菌的研究取得了很大進展，如發(fā)光細菌凍干粉、發(fā)光細菌固體培養(yǎng)試劑盒以及發(fā)光細菌毒性檢測儀的商業(yè)化。因此，急需完善相關的標準政策，以推動該產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展。