沈連麗，莫如榮，張建華，張志杰，馬欣，魏道德

1.湖州市南潯區(qū)菱湖人民醫(yī)院藥劑科，浙江 湖州 313018

2.駐馬店魏道德骨科醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南 駐馬店 463000

腰椎間盤突出癥(Lumbar disc herniation，LDH)是臨床骨科的常見病，主要是在腰椎間盤退變的基礎(chǔ)上，外力因素導(dǎo)致纖維環(huán)破裂，髓核組織從破裂處突出甚至脫出，壓迫鄰近脊神經(jīng)根，產(chǎn)生腰腿疼痛、麻木等癥狀[1～3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)在維持椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)成分的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，MMP是主要的基質(zhì)蛋白降解酶，其酶活性增強(qiáng)將造成基質(zhì)過度降解，導(dǎo)致椎間盤退變，而內(nèi)源性TIMP可直接抑制MMP活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)退變椎間盤中MMP含量升高，TIMP卻相對(duì)不足，這就造成椎間盤內(nèi)蛋白減少、基質(zhì)成分改變[5～6]。魏氏核歸丸是駐馬店魏道德骨科醫(yī)院長期臨床實(shí)踐總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，此方主治腰椎間盤突出癥，能消除腰椎炎癥，減輕水腫，使神經(jīng)壓迫癥狀得以緩解，進(jìn)而起到行氣活血、祛風(fēng)除濕、消炎止痛等功效，但其具體作用機(jī)理尚未闡明。故本研究通過建立LDH大鼠模型，探究魏氏核歸丸對(duì)LDH大鼠病變椎間盤組織MMP2、MMP9、TIMP1表達(dá)的影響，以期為臨床治療LDH提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SPF級(jí)SD健康大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào)：SYXK(京)2017-0022。將大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，包括假手術(shù)組、模型組以及魏氏核歸丸低、中、高劑量組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)。

1.2 藥物 魏氏核歸丸來自駐馬店魏道德骨科醫(yī)院，由杜仲、炒菟絲子、酒當(dāng)歸、狗脊各600 g，續(xù)斷、宣木瓜、獨(dú)活各300 g，土元、醋乳香、醋沒藥各250 g，香附、木香各150 g、骨碎補(bǔ)450 g、醋延胡索500 g、熟地黃900 g和制馬錢子82 g，共16味中藥組成。功效：補(bǔ)腎壯骨、滋肝養(yǎng)筋、行氣活血、祛風(fēng)除濕、扶正祛邪；用法：1次9 g，1天3次，飯后服用。根據(jù)人鼠體表面積等效量法換算出200 g大鼠用藥劑量為1次162 mg，以此作為中劑量，設(shè)低、中、高劑量比例為1∶2∶4，即低劑量為81 mg，高劑量為324 mg。臨用時(shí)將藥丸用生理鹽水配成81、162、324 mg/mL的混懸液。

1.3 動(dòng)物模型制備 10%水合氯醛按照0.5 mL/100 g腹腔麻醉，麻醉起效后右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)，背毛消毒，正中切開鼠尾暴露椎間盤，連續(xù)勾出6個(gè)椎間盤，浸入無菌生理鹽水中，迅速縫合傷口。將1個(gè)椎間盤用生理鹽水稀釋后，攪拌成混懸液備用。于正中切開大鼠背部，暴露L4～L5橫突、刺突，顯微鏡下切開L5左側(cè)椎板，在神經(jīng)根和硬脊膜間置入自體尾椎椎間盤，同時(shí)將尾椎椎間盤稀釋液注入硬膜囊外與神經(jīng)根周緣，注意髓核接觸但未壓迫神經(jīng)根。甲硝唑沖洗后逐層縫合傷口。假手術(shù)組僅暴露神經(jīng)根后縫合傷口，其他操作同上。

1.4 給藥處理 造模后5天，每天注射青霉素8萬U/只預(yù)防感染，正常喂養(yǎng)，至大鼠尾部結(jié)痂。造模5天后連續(xù)灌胃給藥14天，1天3次，每次低劑量組給予1 mL/200 g低濃度藥液(81 mg/mL)；每次中劑量組給予1 mL/200 g中濃度藥液(162 mg/mL)；每次高劑量組給予1 mL/200 g高濃度藥液(324 mg/mL)；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。每天8∶00、13∶30、19∶00各給藥1次。

1.5 行為學(xué)觀察 觀察大鼠有無煩躁不安(如撕咬肢體、不停舔后爪、后足或肢忽而自行抬起)，飲食變化情況，運(yùn)動(dòng)功能是否異常，大小便是否失禁等。

1.6 后肢痛覺實(shí)驗(yàn) 參照陸志東等[7]方法自制大鼠機(jī)械刺激縮爪閾值儀，由血壓計(jì)、5 mL注射器內(nèi)芯和磨禿的20 mL注射器針尖組裝而成。造模前1天、造模后5天、灌胃后7天和14天進(jìn)行測量。測量時(shí)將大鼠放入塑料杯內(nèi)，露出左后肢，大鼠平靜后將自制測量儀針頭置于左后爪4、5趾骨間，接著向血壓計(jì)充氣，大鼠出現(xiàn)尖叫或縮爪時(shí)停止，記錄血壓計(jì)讀數(shù)，以此作為縮爪閾值，間隔20 min測1次，取3次測量值的平均數(shù)。假設(shè)造模前1天的縮爪域值為基礎(chǔ)域值，若高于此值則痛覺遲鈍，若低于此值則痛覺過敏。

1.7 蘇木精-伊紅（HE）染色 末次給藥結(jié)束后，各組隨機(jī)選取大鼠4只，收集腰部髓核，于4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h；脫水后石蠟包埋；用組織切片機(jī)以10μm厚度切片，60℃恒溫箱中烤片3～5 h；切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；蘇木精液染色5 min；水沖洗后75%鹽酸乙醇分化30 s；水沖洗、乙醇處理后酸化伊紅溶液染色2 min；乙醇脫水、二甲苯透明；用中性樹膠封片、烘烤過夜。在光鏡下觀察并拍照。

1.8 酶聯(lián)免疫（ELISA） 檢測 用ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定各組大鼠腰部髓核中MMP2、MMP9、TIMP1含量。將髓核剪成碎片，加入適量標(biāo)本稀釋液，漩渦勻漿。向反應(yīng)板各孔加入100μL樣品，混勻后置于37℃恒溫箱中2 h；反應(yīng)板洗滌并吸干后，加入100μL一抗工作液，混勻后置于37℃恒溫箱中1 h；反應(yīng)板洗滌并吸干后，加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，置于37℃恒溫箱中0.5 h；反應(yīng)板洗滌并吸干后，加入100μL終止液并混勻；0.5 h內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用(±s)表示，方差分析；計(jì)數(shù)資料用“率”描述，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠行為觀察 各組大鼠都沒出現(xiàn)感染、死亡情況。造模后大鼠飲食正常，左后肢出現(xiàn)輕度跛行、避免負(fù)重，無撕咬，沒有大小便失禁情況，易激怒，魏氏核歸丸干預(yù)后情況明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠左后肢機(jī)械刺激縮爪疼痛閾值結(jié)果比較 見圖1。術(shù)后5 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠左后肢縮爪閾值均顯著降低(P＜0.05)。灌胃7天，與模型組比較，高、中劑量組大鼠左后肢縮爪閾值均顯著升高(P＜0.05)，低劑量組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，高劑量組閾值上升最快，但高劑量組與中劑量組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與灌胃7天比較，高劑量組大鼠灌胃14天時(shí)閾值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且閾值趨近于假手術(shù)組(P＞0.05)。

圖1 各組大鼠左后肢機(jī)械刺激縮爪疼痛閾值

2.3 各組大鼠髓核組織HE染色結(jié)果比較 見圖2。假手術(shù)組椎間盤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，多層纖維環(huán)排列整齊，髓核形態(tài)正常。模型組纖維環(huán)大面積壞死，且髓核數(shù)量明顯減少、結(jié)構(gòu)基本消失，周圍出現(xiàn)大量透明骨質(zhì)增生，正常椎間盤結(jié)構(gòu)消失。低劑量組纖維環(huán)壞死明顯減少，髓核數(shù)量有所增加，椎間盤、髓核組織形態(tài)有所恢復(fù)，透明骨質(zhì)增生有所降低。中劑量組顯示椎間盤形態(tài)基本恢復(fù)正常，異常透明骨質(zhì)基本消失，髓核形態(tài)增加，纖維環(huán)形態(tài)數(shù)量恢復(fù)正常，排列整齊。高劑量組顯示椎間盤形態(tài)正常，纖維環(huán)數(shù)量恢復(fù)正常且排列有序，髓核形態(tài)正常。

圖2 各組大鼠髓核組織HE染色結(jié)果 (×100)

2.4 各組大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達(dá)變化結(jié)果比較見表1。灌胃7天和14天，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)，且隨著劑量的升高M(jìn)MP2、MMP9蛋白表達(dá)水平越低，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)；與灌胃7天比較，低、中、高劑量組在灌胃14天時(shí)MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)水平均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 灌胃后各組大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達(dá)變化結(jié)果

2.5 各組大鼠髓核TIMP1蛋白表達(dá)變化結(jié)果比較 見表2。灌胃7天和14天，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠髓核TIMP1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠TIMP1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)，且隨著劑量的升高TIMP1蛋白表達(dá)水平越高；與灌胃后7天比較，低、中、高劑量組大鼠TIMP1蛋白在灌胃14天時(shí)的表達(dá)水平有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠髓核TIMP1蛋白表達(dá)變化結(jié)果

3 討論

LDH在中醫(yī)學(xué)中屬于腰痛、腰腿痛等范疇，基于肝腎脾不足，尤其是腎虛，由外傷或氣滯寒凝等引起[8～9]。中醫(yī)內(nèi)治LDH藥物以補(bǔ)肝益腎、活血化瘀為主[10]。魏氏核歸丸是在傳統(tǒng)核歸丸的基礎(chǔ)上，結(jié)合LDH的病因、癥狀，加入強(qiáng)腰膝、祛風(fēng)濕、固腎氣的狗脊，祛風(fēng)濕、止痛的獨(dú)活，活血、利氣、止痛的醋延胡索等，為駐馬店魏道德骨科醫(yī)院長期臨床實(shí)踐總結(jié)而得，主治腰椎間盤突出、椎管狹窄、腰肌勞損、頸椎間盤突出，在臨床上應(yīng)用多年，取得良好療效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)活血祛瘀藥物可減小血液黏稠度、擴(kuò)張血管，進(jìn)而改善血液循環(huán)，補(bǔ)腎藥物可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、提高機(jī)體免疫力[11～12]。魏氏核歸丸具有補(bǔ)腎壯骨、滋肝養(yǎng)筋、行氣活血、祛風(fēng)除濕、扶正祛邪的功效。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究魏氏核歸丸治療LDH的內(nèi)在分子機(jī)制，為中藥的現(xiàn)代化研究提供參考。

本研究采用自體椎間盤移植方法制備LDH大鼠模型，所有大鼠都未感染、死亡。造模后大鼠左后肢跛行、易激怒。HE染色結(jié)果說明魏氏核歸丸治療可明顯改善LDH大鼠的生物學(xué)行為及其髓核病理特征，且可緩解大鼠痛覺過敏情況。這些結(jié)果與魏氏核歸丸及其他核歸丸的臨床治療效果一致[13～15]。

腰椎間盤退變是LDH發(fā)生的重要內(nèi)因，常表現(xiàn)為椎間盤基質(zhì)成分改變，椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)成分一般處于動(dòng)態(tài)平衡之中，椎間盤退變象征該平衡遭受破壞，MMP及其抑制劑TIMP在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。細(xì)胞外基質(zhì)指位于結(jié)締組織細(xì)胞外圍、內(nèi)皮與上皮細(xì)胞下層，為組織、器官以及生物體提供韌性與強(qiáng)度的物質(zhì)。膠原蛋白、蛋白多糖是椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，胞間框架結(jié)構(gòu)主要有膠原構(gòu)成，而蛋白多糖可與水結(jié)合起著對(duì)抗外壓、分散負(fù)荷的作用。椎間盤由中央髓核和外周纖維環(huán)構(gòu)成，髓核膠原無Ⅰ型多為Ⅱ型，而纖維環(huán)從外向里Ⅰ型膠原不斷減少，Ⅱ型膠原、聚合蛋白多糖逐漸增多[17]。基質(zhì)降解酶系有脯肽酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)6大類，其中MMP分布于多類細(xì)胞中，可廣泛降解多種基質(zhì)，在維持基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮最重要的作用，與癌細(xì)胞擴(kuò)散、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、燒傷、椎間盤退變等病癥及正常組織的吸收、更新密切相關(guān)[18～19]。研究發(fā)現(xiàn)椎間盤退變時(shí)髓核中Ⅱ型膠原被Ⅰ型取代，且有Ⅲ型膠原出現(xiàn)，而聚合蛋白多糖含量下降，硫酸軟骨素與硫酸角質(zhì)素比值下降等生物學(xué)變化[6]。椎間盤退變的直接原因是椎間盤中含有過量的MMP，MMP/TIMP失衡，椎間盤細(xì)胞活性不足，不能維持、修復(fù)胞外基質(zhì)成分。腰部重負(fù)荷、強(qiáng)扭轉(zhuǎn)、駕駛振動(dòng)等機(jī)械因素是引起腰椎間盤突出的常見誘因。研究顯示，腰部負(fù)荷異常改變可導(dǎo)致MMP/TIMP失衡，造成椎間盤基質(zhì)過度降解[20]。本研究結(jié)果顯示，灌胃后7天和14天，模型組、魏氏核歸丸組大鼠髓核MMP2、MMP9、TIMP1蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組均顯著較高，MMP2、MMP9增加量高，而TIMP1增加量相對(duì)較少，說明LDH大鼠髓核MMP2、MMP9、TIMP1含量增多，MMP/TIMP失衡。魏氏核歸丸干預(yù)后MMP2、MMP9表達(dá)水平均顯著低于模型組，TIMP1表達(dá)水平均顯著高于模型組，且隨著魏氏核歸丸劑量的升高，MMP2、MMP9表達(dá)水平越來越低，TIMP1表達(dá)水平越來越高，說明魏氏核歸丸可緩解MMP/TIMP失衡情況，避免胞外基質(zhì)過度降解。由此說明魏氏核歸丸可能通過抑制大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表達(dá)，促進(jìn)TIMP1表達(dá)，來減輕LDH大鼠的病情。

綜上，本研究通過自體椎間盤移植方法成功制備LDH大鼠模型，模型組大鼠腰部髓核中MMP2、MMP9、TIMP1蛋白表達(dá)水平顯著增加，魏氏核歸丸治療后LDH大鼠髓核炎癥明顯減輕，且髓核組織中MMP2、MMP9表達(dá)水平顯著降低，TIMP1顯著升高，說明魏氏核歸丸可抑制髓核MMP2、MMP9蛋白表達(dá)，促進(jìn)TIMP1表達(dá)，緩解LDH大鼠病情。然而LDH發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素很多、相關(guān)機(jī)制復(fù)雜，魏氏核歸丸治療LDH的具體作用機(jī)理還需繼續(xù)深入探究。