王朝輝 辛永寧

1.青島大學 (山東 青島， 266071) 2.青島市第六人民醫(yī)院肝病科 3.青島市市立醫(yī)院消化科

肝細胞癌(HCC)是國內比較常見的一種惡性腫瘤，其不僅具有較高的發(fā)病率，還有很高的死亡率，對人們的生命健康造成了很大的威脅。國內乃至全球，每年都有大量的患者死于肝癌，因此肝癌的發(fā)病機制和臨床治療方案一直是醫(yī)學界的研究熱點[1，2]。 原發(fā)性肝癌具有病程進展迅速、復發(fā)率高且轉移侵襲性強等特點，而且HCC的發(fā)病機制極為復雜，醫(yī)學界截止目前仍未能完全精準的對其轉移和復發(fā)等機制作出定論，這些都導致HCC在臨床治療中的效果不太理想，給臨床醫(yī)生帶來了極大的挑戰(zhàn)[3]。成纖維細胞生長因子受體是一種主要分布在細胞膜蛋白上的受體型蛋白酪氨酸激酶，其中FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4是目前已知的四種類型。FGFR作為一種重要的抗腫瘤藥物靶標，尤其是FGFR4，已經被大量研究證實在乳腺癌、胃癌、胰腺癌的診治中能夠發(fā)揮重要的作用，但是在肝癌中應用的研究較少[4]。本次研究通過對FGFR4基因沉默對HCC細胞生物學行為影響機制進行深入研究，來為HCC的診療提供更多的參考，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 本次實驗所使用的人肝癌細胞株smmc-7721采購于上?；鄯f生物科技有限公司，在本院實驗室進行傳代培養(yǎng)的操作。

1.2 研究方法 本次研究一共設計三條慢病毒載體(siRNA)并選擇出最高效的一種來進行FGFR4的基因沉默，并通過對慢病毒載體質粒重組構建陰性對照質粒，之后進行慢病毒包裝，根據滴度實驗公式檢測病毒滴度是否符合實驗要求，并選擇出最有效率的慢病毒滴度進行轉染操作。本研究設立三組，其中A組為未進行轉染操作的正常細胞組，B組為FGFR4基因序列被打亂后重組的陰性對照組，C組為經慢病毒轉染后的FGFR4基因沉默組。

1.3 觀察指標 將A、B和C三組細胞處理后鋪至96孔板上，在鋪到板上的第一天至第四天，向板上的每個孔中都加入CCK-8試劑，然后使用酶標儀檢測三組細胞的吸光度來判斷三組細胞的增殖能力。構建Transwell小室，然后將三組細胞懸液放置在其上層培養(yǎng)24小時，倒置顯微鏡觀察統(tǒng)計每組細胞穿出上層小室的數量，使用200×光鏡，每組觀察十個視野的細胞數量，對比三組的平均統(tǒng)計結果，判斷三組細胞的侵襲能力。采用流式細胞儀，并根據Annexin V-APC/PI雙染法來觀察和對比三組細胞的凋亡情況。采用Western Blot法檢測三組細胞中相關蛋白的表達情況：pSTAT3、pERK和ERK信號通路相關分子的表達情況；增殖標志物PCNA、上皮標志物E-Cadeherin和間葉細胞標志物Vimentin的表達情況；Bcl-xL、Caspase-3和FLIP等相關凋亡分子的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件作統(tǒng)計學分析，計量資料數以均數±標準差表示，計量資料間均數的差異比較用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組細胞增殖情況 對比發(fā)現，FGFR4基因沉默后(C組)，在第二天到第四天的時間，細胞增殖明顯低于A組和B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組和B組對比，各個時間均無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖1。

圖1 3組細胞增殖情況比較圖

2.2 3組細胞侵襲能力比較 對比發(fā)現，A組和B組的細胞穿出計數(59.8±3.17，61.5±4.26)均顯著高于C組(36.8±5.13)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組和B組兩組間對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 3組細胞凋亡情況 對比發(fā)現，FGFR4基因沉默(siRNA)后的C組細胞凋亡分布的區(qū)域顯著高于A組和B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 3組細胞凋亡分布圖

2.4 3組細胞FGFR4蛋白和相關效應蛋白表達情況 分析結果發(fā)現，FGFR4的蛋白表達對比，A組和B組顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其他效應蛋白的對比中發(fā)現，C組FLIP、PCNA、Bcl-xL、pERK、pSTAT3和Vimentin的表達均顯著低于A組和B組，而Caspase-3和E-cadeherin的表達則顯著高于另外兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

3 討論

HCC作為一種嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤疾病，其治療方法一直是近年來的研究熱點，手術切除和放化療是目前的主要治療方法，但其療效并不理想，尤其是對于患者生存率的提高并不顯著[5，6]。隨著現代醫(yī)學的發(fā)展，分子靶向治療藥物被越來越多的用于臨床治療腫瘤疾病的研究，如VEGF和EGFR等，其在乳腺癌、肺癌等腫瘤疾病的臨床治療中已經取得了非常明顯的進展，但是這些并沒有給肝癌的臨床治療帶來幫助[7，8]。找到一種有效的治療靶點，對于HCC的治療意義重大。近年來人們越來越多的開始關注FGFR家族，尤其是FGFR4，作為一種重要的抗腫瘤藥物靶標被國內外的研究者和藥物專家所廣泛關注[9]。

國外的一些研究將FGFR4沉默應用到乳腺癌以及結腸癌細胞系中發(fā)現，癌細胞都因FGFR4的沉默，而出現了顯著的侵襲能力減弱，增殖能力受到抑制，而且細胞存活率也明顯下降[10]。本次研究通過對比不同處理因素下三組間的細胞吸光度差異后發(fā)現，C組吸光度顯著低于另外兩組，而另外兩組間對比無明顯差異，細胞吸光度的高低可以反映細胞的生存率，即細胞的增殖能力，而本次研究結果證實，肝癌細胞受到FGFR4被沉默的影響，增值能力明顯得到了抑制。對細胞穿越計數統(tǒng)計發(fā)現，受到FGFR4被沉默的影響，C組肝癌細胞穿越數量顯著降低，這說明C組癌細胞的侵襲能力顯著降低。對三組細胞凋亡情況的分析，發(fā)現C組細胞凋亡數量明顯高于另外兩組，細胞凋亡率明顯升高。這些研究結果均與國內外將FGFR4沉默應用于其他惡性腫瘤疾病的研究結果一致[11]。我們通過進一步對三組間相關效應蛋白表達情況的對比發(fā)現，Bcl-xL和FLIP作為重要的凋亡通路和相關凋亡分子，增殖標志物PCNA都在C組出現了明顯的降低，而Caspase-3的表達顯著升高，這進一步證實HCC細胞的增殖能力被明顯抑制。pERK和pSTAT3兩種蛋白表達受到FGFR4沉默的影響明顯降低，這表明FGFR4沉默后，對這兩種信號通路產生了顯著的影響，進而對HCC細胞的生物學特性產生了重要影響。而C組間充質標記Vimentin蛋白表達的明顯降低和上皮標記E-Cadeher表達的增高，說明FGFR4沉默后對上皮-間葉轉化的通路表達產生了抑制作用，這與國外關于結腸癌的此類研究結果相一致[12]。

綜上所述，FGFR4沉默后，肝癌細胞的增殖能力受到了顯著的抑制，癌細胞侵襲性明顯下降，肝癌細胞的凋亡率顯著上升。這一特性在肝癌的臨床治療中，能夠發(fā)揮巨大的作用，值得進行深入研究。