熊益群 梁越進(jìn) 徐文軍 劉心亮 穆桂萍 徐紹剛 劉文赫 袁東凱 王靜娜

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所 (廣東 深圳, 518033) 2.美國德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)分校免疫實(shí)驗(yàn)室 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生班

病毒性肝炎是我國臨床常見的傳染性疾病，與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，發(fā)病機(jī)制與病毒感染、免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。而調(diào)控免疫，達(dá)到控制病情、延緩疾病進(jìn)展，與抑制肝炎病毒的復(fù)制同為目前的重要治療手段。為此，我們對(duì)臨床驗(yàn)方補(bǔ)益涼解法方進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，以探討其免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6 (B6)小鼠，SPF級(jí)，6～8 周齡，雌性，體重20～25g。

1.1.2 主要試劑：IL-33 ELISA試劑盒、sST2-ELISA試劑盒、淋巴細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞裂解液、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜、重組IL-33、磷酸鹽緩沖液(PBS)等。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、OLYMPUS倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、自動(dòng)平衡離心機(jī)、化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、熒光定量PCR儀、多功能酶標(biāo)儀、BI0-PLEX平臺(tái)等。

1.1.4 藥物 補(bǔ)益涼解方：生地、丹皮、山茱萸、女貞子、桑寄生、仙茅、五味子、黃芪、白術(shù)、川萆薢、川樸、葉下珠。水煎醇提制成,含生藥量2g/ml,冷藏備用(深圳市中醫(yī)院制劑室制備)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模、分組與用藥 根據(jù)治療方案將小鼠隨機(jī)分成6組：空白組、模型組、補(bǔ)益涼解方大、中、小劑量組，以及IL-33組。除空白組外，其余各組小鼠均行腺病毒3×109PFU(AdLacZ)尾靜脈注入以建立小鼠急性肝炎模型，空白組小鼠尾靜脈注射等容積生理鹽水。用藥(IL-33和補(bǔ)益涼解方)前，對(duì)小鼠血清AdLacZ病毒量、ALT、AST、IL-33、sST2進(jìn)行檢測。

補(bǔ)益涼解法3組小鼠分別給予補(bǔ)益涼解方大、中、小劑量灌胃(分別含生藥5.84g/ml、2.92g/ml、1.46g/ml)；IL-33組小鼠按0.8μg/只連續(xù)5天腹腔注射鼠重組IL-33；模型組小鼠以等容積PBS液腹腔注射，連續(xù)5天。第6天經(jīng)小鼠眼眶取外周靜脈血，處死小鼠采集肝組織標(biāo)本。

1.2.2 AdLacZ病毒量測定 尾靜脈注射腺病毒3×109PFU(AdLacZ)后0、0.5、1、3、6天取3只小鼠取血檢測ALT、AST；頸椎脫臼處死動(dòng)物后，取肝組織用0.5%戊二醛固定30分鐘，切片用0.2mg/ml的X-gal在37℃孵育120分鐘。感染的細(xì)胞因?yàn)橛笑?gal 活性而被染成藍(lán)色，而未感染的細(xì)胞用中性紅復(fù)染。每個(gè)肝臟選取8個(gè)視野，用顯微鏡拍照，用Image-Pro Plus 6.0 software分析感染的肝臟細(xì)胞占整個(gè)肝臟細(xì)胞的比例。

1.2.3 肝組織病理學(xué)觀察 肉眼觀察各組大鼠肝臟體積大小、色澤、質(zhì)地、包膜緊張度等。用10%福爾馬林固定肝臟組織，切片，用蘇木素伊紅染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理。用Knodell評(píng)分系統(tǒng)打分。正常的肝臟沒有損傷或細(xì)胞浸潤，打分0；在門靜脈有少數(shù)細(xì)胞浸潤，但并無蔓延至肝小葉區(qū)，同時(shí)，伴隨肝小葉區(qū)有凋亡或壞死的細(xì)胞為2分； 大量的細(xì)胞浸潤在門靜脈區(qū)，擴(kuò)散的凋亡和壞死為3分。

1.2.4 肝功能指標(biāo) 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

1.2.5 免疫相關(guān)指標(biāo) 血清及肝組織IL-33、sST2，血清IFN-γ和 IL-2含量。

1.2.6 T淋巴細(xì)胞亞群分析 ①分離細(xì)胞亞群 肝臟原位灌注、膠原酶消化，30% 和 70% 的Percoll (Sigma) 梯度離心法純化細(xì)胞。脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離自補(bǔ)益涼解方、IL-33處理的小鼠。脾臟淋巴細(xì)胞分離：小鼠脫頸椎處死后，脾臟被置入75微米的尼龍膜中擠壓，制成單細(xì)胞懸液，再加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。對(duì)于lineage陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞的分離。細(xì)胞首先用Fc阻斷劑(clone 2.4G2, eBioscience) 孵育，然后再加入FITC標(biāo)記的CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, B220, NK1.1, Ter-119 和 Gr-1 (eBioscience) 抗體孵育30min。細(xì)胞洗滌之后，再用anti-FITC的磁珠孵育，再以LD柱陰選以分離lineage陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞。

②淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 分離的細(xì)胞種在24孔板，每孔106個(gè)細(xì)胞，分別加以含有IL-33 10 ng/ml 、補(bǔ)益涼解方不同濃度及IL-2、IL7(10 ng/ml)的培養(yǎng)液，48h后以流式細(xì)胞儀檢測。Lin-細(xì)胞以1×105/ml的密度種在6孔板內(nèi)，用含IL-2、7和33(10mg/ml)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

③流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞首先用Fc阻斷劑孵育，然后再與熒光抗體孵育，接著用熒光二抗孵育。對(duì)于胞內(nèi)染色而言，細(xì)胞用PMA (50ng/ml, Sigma)、 ionomycin (750 ng/ml, Sigma) 和GolgiStop (1μl/ml BD Bioscience) 一起孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，細(xì)胞用eBioscience公司的試劑盒固定破膜，再染色胞內(nèi)因子。流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)的肝臟淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+、CD11b+、 CD11c+、NK及CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞水平，分析培養(yǎng)后的脾臟淋巴細(xì)胞液CD11b、CD11c、NK、CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞及IFN-γ+CD4+、IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用多因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間各項(xiàng)指標(biāo)變化 見圖1。

圖1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間各項(xiàng)指標(biāo)變化圖

血清ALT水平在第3天開始，持續(xù)上升至第6日(見圖1A)，肝IL-33和ST2在同一時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)同一模式，截止感染后第6天內(nèi)，肝內(nèi)和血清IL-33水平較空白組小鼠顯著升高(見圖1B，P<0.01，P<0.05)。腺病毒注射引起顯著的肝門及小葉區(qū)淋巴細(xì)胞滲透，橋接壞死伴隨嗜酸性小體在三個(gè)相鄰的區(qū)域被發(fā)現(xiàn)(見插頁彩圖1C，箭頭所示)。補(bǔ)益涼解法小劑量組和模型組在肝組織學(xué)分?jǐn)?shù)方面不具可比性(P>0.05)(見圖1D)，補(bǔ)益涼解法小劑量組嗜酸性小體數(shù)目顯著降低(P<0.05)(見圖1E)，同時(shí)顯著降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清ALT水平(P<0.01)(見圖1F),與IL-33組相比，作用相似(P>0.05)。

2.2 各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間T淋巴細(xì)胞亞群變化情況 見圖2。圖2A所示，注射AD病毒各組小鼠第6天，可見肝內(nèi)淋巴細(xì)胞聚集程度是空白組的8倍之多，而且1/2的肝內(nèi)淋巴細(xì)胞(IHL)是CD8+T細(xì)胞。 IHL的數(shù)目并未被補(bǔ)益涼解法治療所改變，這與肝組織學(xué)分?jǐn)?shù)是相同的。補(bǔ)益涼解法組和模型組小鼠肝內(nèi)浸潤的CD4+和CD8+T細(xì)胞群中被激活的T細(xì)胞亞群(CD44hiCD62Llo)并不具備可比性(P>0.05)(見圖2B)，這表明補(bǔ)益涼解法并不影響炎癥肝臟內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞的遷移，但能顯著減少CD11b+, CD11c+和NK細(xì)胞的數(shù)量(分別為P<0.05，P<0.01，P<0.01), 同時(shí)增加了Treg細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)(見圖2C)。NK細(xì)胞和Treg細(xì)胞的這種減少或增加的情況同樣發(fā)生在脾臟(分別為P<0.01，P<0.01)(見圖2D)。 補(bǔ)益涼解法降低CD11b+和CD11c+細(xì)胞上MHCII的表達(dá)和CD11b+、CD11c+細(xì)胞CD80的表達(dá)。根據(jù)兩組小鼠肝內(nèi)β-gal活性程度，推測補(bǔ)益涼解法組AD肝內(nèi)病毒清除率情況(見插頁圖2E)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示補(bǔ)益涼解法組和模型組感染后6天感染率分別為(10.6% ± 0.8%)和(7.3% ± 0.7%)，感染后14天感染率分別為(0.8% ± 0.2%)和(0.7% ± 0.3%)，AD病毒在感染后21天基本完全消失(每一組均<0.1%)。PCR方法測定肝組織內(nèi)病毒載量結(jié)果與β-gal方法的結(jié)果一致，兩組小鼠的肝內(nèi)病毒基因表達(dá)穩(wěn)定下降。但補(bǔ)益涼解法與PBS肝內(nèi)病毒清除率并無明顯差別(P>0.05)(插頁圖2E)。

圖2 各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間T淋巴細(xì)胞亞群變化圖

2.3 各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)變化 為了更進(jìn)一步研究補(bǔ)益涼解法中藥在減輕肝損傷中的機(jī)制，我們對(duì)補(bǔ)益涼解法處理后小鼠炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測。肝內(nèi)IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞百分比，補(bǔ)益涼解法組相對(duì)模型組顯著增加(見插頁圖3A)。補(bǔ)益涼解法組小鼠血清IFN-γ和IL-2水平上調(diào)(分別為P<0.01，<0.05)(見圖3B)，IFN-γ、顆粒酶B和穿孔素在兩組間差異均有顯著性意義(分別為P<0.05，P<0.05，P<0.05)(見圖3C)，表示補(bǔ)益涼解法能夠增強(qiáng)病毒性肝炎小鼠1型免疫應(yīng)答。

圖3 各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間CTL變化圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)益涼解法驅(qū)動(dòng)了肝內(nèi)和血清1型(IL-2和IFN-γ)免疫應(yīng)答，原有的細(xì)胞因子和趨化因子微環(huán)境聚集了大量高活性CD8+和CD4+T細(xì)胞至肝內(nèi)。但是，IL-33/ST2相互作用引起的這種激進(jìn)的免疫行為并沒有進(jìn)一步加重肝損傷，從鏡下肝組織嗜酸性小體的明顯減少和血清ALT水平明顯下降來看，它限制了肝損傷的進(jìn)一步發(fā)展。因此，它可能通過某些直接或間接的調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)著肝臟潛在的保護(hù)效應(yīng)。

IL-33[1～2]是炎癥反應(yīng)和免疫偏倚的重要調(diào)節(jié)因子，既可以作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，又可以分泌至胞外結(jié)合受體，作為細(xì)胞因子發(fā)揮作用。在不同疾病中，IL-33發(fā)揮著不同生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，對(duì)正常細(xì)胞的存活增殖及多種疾病的發(fā)病發(fā)展都具有重要作用。

研究結(jié)果顯示，模型組小鼠IL-33/ST2及ALT、AST均有升高，補(bǔ)益涼解法組(小劑量占優(yōu))小鼠肝功能復(fù)常，IL-33/ST2也隨之下降，表明IL-33/ST2的升高確與肝臟炎癥有關(guān)。

補(bǔ)益涼解法組方原則為涼血滋腎益氣，兼清熱解毒化濕。方中山茱萸、桑寄生、仙茅、女貞子、五味子滋腎，地黃、牡丹皮涼血散血；黃芪、白術(shù)健脾益氣；川萆薢、川樸理氣化濕；葉下珠清熱解毒。全方配伍，合清、透、活、補(bǔ)為一體，補(bǔ)中有清，清中有透?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，方中的大多數(shù)中藥被證實(shí)具有調(diào)節(jié)免疫和抗病毒的作用。

研究表明山茱萸多糖可明顯提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù);可顯著促進(jìn)小鼠溶血素的形成,并顯著促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[3]。山萸與清熱利濕解毒類中藥配伍，可抑制亢進(jìn)的體液免疫反應(yīng)。五味子具有護(hù)肝降酶，抗菌，提高免疫功能，增強(qiáng)免疫力的作用[4]。黃芪[5]能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)新陳代謝，抑制病毒，殺菌，調(diào)節(jié)血糖，改善心功能，有保護(hù)肝臟，降低血壓等作用[5]；白術(shù)能促進(jìn)細(xì)胞免疫，抗菌，保護(hù)肝臟的作用[6]。生地中其地黃多糖均可使小鼠的脾指數(shù)顯著提高，單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)，還可明顯促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖，使腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性增強(qiáng)[7]。丹皮酚使小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯提高，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，對(duì)特異性細(xì)胞免疫功能有明顯的作用，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能[8]。葉下珠有效成分鞣質(zhì)對(duì) HBeAg具有明顯的抑制作用，多糖類是一種綠色免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活體內(nèi)免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體正氣[9]。其復(fù)方制劑及葉下珠提取物均有很好的護(hù)肝降酶作用，AST和 ALT明顯下降，肝脾腫大情況明顯緩解。萆薢對(duì)小鼠單核巨噬系統(tǒng)的功能有明顯的促進(jìn)作用。

補(bǔ)益涼解法防護(hù)病毒性肝損傷的作用機(jī)制可能是通過免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了Th1類細(xì)胞因子的表達(dá)，下調(diào)IL-33/ST2的表達(dá)，從而降低肝臟損傷。而補(bǔ)益涼解法對(duì)病毒的影響，盡管其清除率較對(duì)照組高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不大。