雷 波 詹 傲 張 召 張孝禮 萬(wàn)曉強(qiáng)

膠質(zhì)瘤是人類最致命的惡性腫瘤之一，每年導(dǎo)致超過(guò)40萬(wàn)人死亡[1]，5年生存率低于15%[2]。目前，常用的膠質(zhì)瘤經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物有血清鱗狀細(xì)胞癌抗原(serum squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、碳水化合物抗原(carbohydrate antigen ，CA)19-9、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ，CEA)，但在早期診斷中缺乏敏感性和特異性[3-4]。因此，探索新的標(biāo)志物對(duì)早期發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤十分重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA ，lncRNA)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)堿基，缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，通過(guò)調(diào)控致癌和腫瘤抑制途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。lncRNA在多種腫瘤中常表達(dá)失調(diào)，其異常表達(dá)可作為多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌的潛在診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物[7-11]。本研究探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA ATB(long-chain non-coding RNA ATB，lncRNA ATB)在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及調(diào)控miR-144對(duì)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 病理組織收集 收集2017年1月至2018年1月樂(lè)山市人民醫(yī)院術(shù)前病理檢查確診為膠質(zhì)瘤并行手術(shù)切除的腫瘤組織30份，同時(shí)取距癌灶2 cm的癌旁正常組織30份。取材后將組織樣品迅速放在入液氮中保存，至RNA提取。所有患者術(shù)前未行新輔助化療、放療，無(wú)手術(shù)禁忌證，并隨訪其生存時(shí)間和狀態(tài)。本研究通過(guò)院倫理委員會(huì)審批，患者及家屬術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、SHG44和SWO-38購(gòu)于上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞研究所。1640培養(yǎng)基和0.25%胰酶購(gòu)于美國(guó) Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)?？寺」?，si-ATB購(gòu)于上海吉瑪有限公司。U87、U251、SHG44和SWO-38胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，每隔3 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底進(jìn)行傳代。以下所有試驗(yàn)均取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用PBS緩沖液將細(xì)胞清洗干凈，重復(fù)3次，胰酶消化細(xì)胞2 min，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌15 mL離心管，離心并計(jì)數(shù)細(xì)胞，以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，使融合率達(dá)70%左右，使用無(wú)血清培養(yǎng)基按3 μL/L進(jìn)行稀釋轉(zhuǎn)染試劑，37℃孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基分別將si-ATB和對(duì)照組按50 μmol/L濃度稀釋，常溫下孵育5 min，最后與轉(zhuǎn)染試劑等體積分別混勻，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞狀態(tài)，并將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞RNA，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分為慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和空白病毒轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染si-ATB為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空白慢病毒為對(duì)照組。

1.4 定量實(shí)時(shí)PCR分析 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s，60℃15 s，45個(gè)循環(huán)，獲取熒光信號(hào)溫度為60℃。普通DNA PCR檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。ATB序列：正向5’-AAATATGGCGGCGTCTA CACGGA-3’，反向5’-TCCAGAACCCTCTGACATTTGCCT-3’；miR-144引物序列：正向5’-AATCAGAGTACATGCGACTGAGA-3’， 反向5’-GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC-3’。

1.5 平板克隆細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 首先消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁，觀察細(xì)胞狀態(tài)，吸出培養(yǎng)基，避光條件下，分別加入慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，37℃孵育24 h；檢測(cè)不同組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目，并統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將5×104個(gè)轉(zhuǎn)染慢病毒后的細(xì)胞置于上室，并加入Matrigel基質(zhì)膠，將10%FBS的培養(yǎng)基置于下室中。在37℃下孵育24 h后，細(xì)心去除上膜表面的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來(lái)水沖洗干凈后，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) ATB基因野生型3’UTR、突變型3’UTR片段，兩端均設(shè)計(jì)XbaⅠ酶切位點(diǎn)，插入熒光素酶基因質(zhì)粒構(gòu)建 pGL3-3’UTR野生型(wild type，wt)、pGL3-3’UTR突變型(mutant type，mut)， 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h根據(jù)操作說(shuō)明，裂解細(xì)胞，加入熒光素酶底物，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.8 裸鼠腫瘤異種移植模型 將si-ATB組和對(duì)照組U87細(xì)胞按1×106/孔濃度分別注射到4～6周齡裸鼠的腋窩下。飼養(yǎng)8周后檢測(cè)兩組裸鼠異種移植物的體積和質(zhì)量生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA ATB在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)及和生存率之間的關(guān)系 通過(guò)qPCR檢測(cè)lncRNA ATB在膠質(zhì)瘤組織中和癌旁正常組織中的表達(dá)差異，癌組織中l(wèi)ncRNA ATB的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織[(3.84±0.32)比(1.21±0.15)，t=12.670,P=0.003]。同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行隨訪，通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA ATB的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的生存情況相關(guān)(χ2=9.348，P=0.016)，見(jiàn)圖1。

圖1 lncRNA ATB表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的生存情況分析

2.2 lncRNA ATB在細(xì)胞株中的表達(dá)水平及慢病毒轉(zhuǎn)染情況 通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA ATB在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，lncRNA ATB在U87細(xì)胞株表達(dá)水平相對(duì)升高，與其他細(xì)胞株相比，表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(2.12±0.32)比(3.36±0.35)比(1.26±0.23)比(0.86±0.11)，t=12.516,P=0.023；t=14.112,P=0.011；t=11.957,P=0.005]。通過(guò)使用si-ATB1和si-ATB2轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞后，lncRNA ATB的相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[U521si-ATB1:(1.01±0.02)比(0.56±0.02)，t=23.029，P=0.005；U521si-ATB2:(1.01±0.02)比(0.43±0.01)，t=43.078，P=0.003；U87si-ATB1:(1.03±0.01)比(0.44±0.02)，t=46.561，P=0.003；U87si-ATB2:(1.03±0.01)比(0.49±0.03)，t=37.912，P=0.004]。

2.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA ATB和miR-144之間的關(guān)系 通過(guò)檢測(cè)到lncRNA ATB與miR-144具有相似的結(jié)合位點(diǎn)，兩者可能存在內(nèi)在調(diào)控關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA ATB與miR-144之間的聯(lián)系，通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。過(guò)表達(dá)miR-144后，野生型lncRNA ATB的熒光素酶活性受到明顯抑制[(1.95±0.05)比(0.83±0.15)，t=37.064，P=0.002]，而對(duì)突變型lncRNA ATB的熒光素酶活性影響不大[(1.93±0.02)比(2.01±0.05)，t=1.752，P=0.149]，顯示miR-144可以直接與lncRNA ATB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并影響熒光素酶活性。

2.4 ATB對(duì)細(xì)胞株增殖能力的影響 通過(guò)平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA ATB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87和U251增殖能力的影響。首先使用特異的干擾RNA(si-ATB)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ATB的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染si-ATB 24、48和72 h后，U87和U251細(xì)胞的增殖能力低于各自對(duì)照組[U521si-ATB1:(0.56±0.05)個(gè) 比(0.23±0.02)個(gè)，t=34.762，P=0.003；U521si-ATB2:(0.56±0.05)個(gè) 比(0.19±0.04)個(gè)，t=48.180，P=0.002；U87si-ATB1:(0.50±0.06)個(gè) 比(0.18±0.02)個(gè)，t=51.309，P<0.001；U87si-ATB2:(0.50±0.06)個(gè) 比(0.21±0.05)個(gè)，t=39.030，P=0.003]。詳見(jiàn)圖2。

圖2 lncRNA ATB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251增殖能力的影響

2.5 lncRNA ATB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株凋亡行為的影響 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)lncRNA ATB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。lncRNA ATB的下調(diào)提高了U251[(14.2±0.5)% 比 (7.2±0.4)%比(4.6±0.3)%；t=13.324、P=0.0347，t=10.471、P<0.001]和U87[(13.9±0.7)% 比 (10.1±0.3)% 比 (5.6±0.4)%；t=14.760、P=0.033，t=16.682、P=0.002]凋亡百分比。詳見(jiàn)圖3。

2.6 lncRNA ATB對(duì)細(xì)胞株侵襲能力的影響 抑制lncRNA ATB 72 h后，U251細(xì)胞[(186.4±12.4)個(gè) 比 (73.6±8.6)個(gè) 比 (62.6±5.6)個(gè)；t=10.269、P<0.001，t=11.587、P=0.001]和U87細(xì)胞[(192.2±15.3)個(gè) 比(63.6±6.3)個(gè) 比(68.3±7.6)個(gè)；t=14.432、P<0.001，t=13.783、P<0.001]的侵襲能力降低。詳見(jiàn)圖4。

2.7 lncRNA ATB對(duì)裸鼠移植瘤的影響情況 通過(guò)裸鼠異種移植腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定移植瘤體積和質(zhì)量情況。將si-ATB轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞分別注射入裸鼠，在注射后28 天，將小鼠處死并取腫瘤。與對(duì)照組相比，si-ATB組平均腫瘤體積小于對(duì)照組[(846.3±26.3)mm3比 (306.5±19.9)mm3,t=15.332,P<0.001]，且si-ATB組平均腫瘤質(zhì)量也低于對(duì)照組[(0.62±0.23)g 比 (1.52±0.24)g,t=10.580,P<0.001]。詳見(jiàn)圖5。

圖3 lncRNA ATB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251凋亡的影響

圖4 lncRNA ATB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株侵襲能力的影響

圖5 lncRNA ATB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠成瘤模型的影響

3 討論

lncRNA ATB作為癌癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控分子[12-13]，其可能會(huì)成為膠質(zhì)瘤最有潛力的治療靶點(diǎn)。lncRNA作為一種新型腫瘤標(biāo)志物，檢測(cè)血循環(huán)中RNA已成為非侵入性診斷應(yīng)用的新方向[14]。然而，目前關(guān)于早期檢測(cè)膠質(zhì)瘤患者血循環(huán)中l(wèi)ncRNA水平的研究較少，本研究就此開(kāi)展此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

有報(bào)道指出，lncRNA ATB在乳腺癌，結(jié)、直腸癌，食管鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)，并且促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及影響生存率[15]。本研究首次證明了lncRNA ATB在膠質(zhì)瘤中的調(diào)控方式，并揭示lncRNA ATB表達(dá)與膠質(zhì)瘤的侵襲性生物學(xué)行為相關(guān)，同時(shí)在動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)lncRNA ATB的表達(dá)下調(diào)可以直接影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成瘤能力。此外，lncRNA ATB表達(dá)高的患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多，晚期和組織學(xué)分化程度高于lncRNA ATB表達(dá)低的患者[13]。

lncRNA ATB在體外調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡[13]。lncRNA ATB在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞侵襲，lncRNA ATB的敲低降低了乳腺癌細(xì)胞侵襲能力，同時(shí)抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)了細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且在多種腫瘤組織中都存在lncRNA ATB的表達(dá)異常[15-17]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)siRNA介導(dǎo)的ATB導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、集落形成效率和侵襲能力顯著降低及細(xì)胞凋亡顯著增加，推測(cè)lncRNA ATB調(diào)控miR-144的表達(dá)影響膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

本研究表明，lncRNA ATB在膠質(zhì)瘤患者中存在過(guò)表達(dá)狀態(tài)，且在一定程度上表明預(yù)后差，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲并減少癌細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。此外，lncRNA ATB可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-144的表達(dá)參與下游信號(hào)通路的介導(dǎo)，lncRNA可能是未來(lái)膠質(zhì)瘤治療中有價(jià)值的預(yù)測(cè)標(biāo)志和新的治療靶標(biāo)。