陳天拓 何晶晶 蘇義林 朱 凱

兒童期腎臟腫瘤多數(shù)來源于腎胚芽組織且多為惡性腫瘤，其中最常見的為腎母細胞瘤。Max Wilms于1899年對這類腫瘤的特點進行了描述，故稱Wilms瘤。腎母細胞瘤約占小兒實體瘤的8%，并有一定的家族遺傳性，目前認為其發(fā)病機制與WT基因突變和/或腎源性剩余有關(guān)[1]。根據(jù)腫瘤干細胞假說，腫瘤由一小部分維持正常干細胞共同特征的腫瘤干細胞維持。隨著對腫瘤干細胞的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞是惡性腫瘤的根源，其含量與腫瘤的惡性程度、預(yù)后存在相關(guān)性[2]。CD133首先被發(fā)現(xiàn)是造血系統(tǒng)干細胞和祖細胞的標志物[3]，隨后發(fā)現(xiàn)在很多類型腫瘤的干細胞中均表達CD133[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CD133是小兒惡性腫瘤中最常見的干細胞標志物，包括腎母細胞瘤[5]、神經(jīng)母細胞瘤[6]、肝母細胞瘤[7]和骨肉瘤[8]。CD133的表達與神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生和進展相關(guān)，可作為其重要的預(yù)后分子標志物。CD44是細胞表面糖蛋白，主要表達于淋巴細胞、單核細胞和粒細胞，同時也發(fā)現(xiàn)是乳腺癌[9]、頭頸腫瘤[10]、胰腺癌[11]和腸癌[12]干細胞標志物。本研究探討腫瘤干細胞標志物CD133和CD44在腎母細胞瘤中的表達水平及其與患者臨床分期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2017年10月在安徽省立醫(yī)院未進行放化療而直接進行手術(shù)治療的腎母細胞瘤患者，收集HE染色結(jié)果、病理報告以及臨床病理參數(shù)(包括年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度等)。

1.2 試劑和設(shè)備 多聚甲醛、石蠟、乙醇和二甲苯購自國藥集團；抗體稀釋液、蘇木素染液、封片劑、免疫組化檢測(SP法)試劑盒(SP-9000)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CD133(ab19898)和CD44(ab6124)單克隆抗體購自英國Abcam公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司(CX31)；石蠟包埋機(EG1150)和切片機(RM2235)購自德國徠卡公司；離心管、槍頭和EP管購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司。

1.3 組織切片制備和免疫組織化學(xué)染色 新鮮腫瘤組織用生理鹽水漂洗1次后用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成2～5 μm厚組織切片。免疫組織化學(xué)染色步驟按照試劑盒說明書進行。蘇木精復(fù)染后，自來水洗15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 免疫組織化學(xué)評分 為定量檢測CD133和CD44在腎母細胞瘤組織中的表達情況，采用標準計分法將CD133和CD44的表達進行半定量分析，結(jié)果判定采用雙盲法，由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師共同進行。評分標準如下：根據(jù)胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)的顏色深淺判定陽性信號強度，無色為陰性記為0分，淺黃色為弱陽性記為1分，棕黃色為中等強度記為2分，棕褐色為強陽性記為3分。在高倍鏡下(200倍)對每張切片隨機選取5個視野，計算視野中陽性細胞百分比，最終的免疫組織化學(xué)評分按照陽性信號強度×陽性細胞百分比，評分范圍為0～300分，以評分的中位數(shù)作為臨界值來區(qū)分陰性和陽性標本[13]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用頻數(shù)和率表示，率的比較采用χ2檢驗或校正的χ2檢驗，相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般特征 共收集腎母細胞瘤患兒64例，其中男性30例(47%)，女性34例(53%)。年齡中位數(shù)為36個月(8～120個月)，其中46例(74%)年齡≤36個月。腫瘤大小(最大直徑)2～19 cm，中位數(shù)6.5 cm，其中32例(50%)≤6.5 cm。其中58例(91%)表現(xiàn)為預(yù)后好的病理特征；6例(9%)表現(xiàn)為預(yù)后差的病理特征，這6例中4例為局灶性增生，2例為彌漫性病變。根據(jù)NWTS分期[14]， 24例(37%)為1期，26例(41%)為2期，4例(6%)為3期，8例(12%)為4期，2例(3%)為5期。

2.2 CD133和CD44在腎母細胞瘤中的表達情況 CD133陽性信號強度分析顯示，87%(56/64)的標本為陽性，其中44%(28/64)為弱陽性，37%(24/64)為陽性，6%(4/64)為強陽性；CD133陽性細胞計數(shù)顯示，28%(18/64)的標本CD133陽性細胞數(shù)≥50%。CD44陽性信號強度分析顯示，25%(16/64)的標本為陽性，其中13%(8/64)為弱陽性，6%(4/64)為陽性，6%(4/64)為強陽性；CD44陽性細胞計數(shù)顯示，13%(8/64)的標本CD133陽性細胞數(shù)>50%(見圖1)。分別計算CD133和CD44最終的免疫組織化學(xué)評分，計算結(jié)果顯示評分的中位數(shù)為100分，因此，使用100分作為區(qū)分標本陰性和陽性的臨界值，其中44%(28/64)的標本為CD133陽性，13%(8/64)的標本為CD44陽性。

2.3 CD133的表達情況與腎母細胞瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 CD133的免疫組織化學(xué)評分與腎母細胞瘤NWTS分期存在正相關(guān)性(r=0.813，P=0.047)。在4期標本中CD133的陽性率為87.5%，而在1期標本中CD133的陽性率為25.0%(6/24)。此外，女性患者CD133評分高于男性患者(P<0.05)，但CD133評分與患者的年齡、腫瘤的大小及病理特征無相關(guān)性(P>0.05)。詳見表1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測CD133和CD44在腎母細胞瘤中的表達(HE×100)

3 討論

腫瘤干細胞是腫瘤細胞中的一小部分，它具有干細胞的特性(如自我更新)，能夠多向分化以及導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，表達一系列獨特的分子標志物(如CD44和CD133)[15]。本研究探討了2個重要的腫瘤干細胞標志物CD133和CD44在腎母細胞瘤中的表達情況，及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。通過免疫組織化學(xué)評分分析CD133和CD44在腎母細胞瘤中的表達情況顯示，CD133在44%(28/64)的腎母細胞瘤中為陽性，但與CD133相比，CD44在腎母細胞瘤中的陽性率較低，僅為13%(8/64)。與其他腫瘤類似，在腎母細胞瘤中表達CD133的腫瘤細胞數(shù)目超過腫瘤干細胞的數(shù)目，因此單獨檢測CD133的表達水平不能用于鑒別腫瘤干細胞。目前，研究人員正試圖確定特定的標記或通過一組標志物來定義純腫瘤干細胞亞群。作為有效的靶向治療腫瘤干細胞標志物，必須能夠識別所有腫瘤細胞且只在腫瘤干細胞上表達[16]。在兒科腫瘤中已經(jīng)鑒定的腫瘤干細胞標志物數(shù)量有限，CD133是常見標志物之一，然而它遠非完美的干細胞標志物。此外，在人腦膠質(zhì)瘤中CD133是生物能量學(xué)的壓力標志物，在缺氧條件下CD133的表達水平顯著增加[17]，但還不能確定增加的C133陽性細胞是來自腫瘤起始亞群還是來自有抗性的細胞群體。

人類腎臟腫瘤發(fā)生與器官發(fā)育有密切聯(lián)系[18]。對人胎腎干細胞標志物和腎母細胞瘤中惡性腎干細胞標志物鑒定結(jié)果顯示，腎母細胞瘤起源于腎干細胞的過度增殖和積累[19]。針對腎母細胞瘤手術(shù)切除組織中干細胞標志物的研究[5]顯示，其中表達CD133和神經(jīng)細胞黏附分子(CD56)，表明該腫瘤組織中存在干細胞，克隆形成實驗顯示，只有表達CD56的細胞具有高克隆形成能力以及過表達腎母細胞瘤預(yù)后不良相關(guān)基因TOP2A。在腎母細胞瘤中分析CD133的表達水平與腫瘤分期及預(yù)后相關(guān)性的研究較少。已有研究顯示，CD133與兒童腫瘤相關(guān)，如骨肉瘤[8]和橫紋肌肉瘤[20]；在膠質(zhì)母細胞瘤中，CD133陽性細胞比例與化療耐藥性有強相關(guān)性，因此將CD133作為起源于神經(jīng)嵴腫瘤的干細胞標志物[21]；在神經(jīng)母細胞瘤中，CD133的陽性率與腫瘤INSS分期和分化水平低相關(guān)[6]；在兒童惡性黑色素瘤中，CD133與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[22]。本研究使用CD133作為腫瘤干細胞標志物分析腎母細胞瘤中陽性率達到44%，而且陽性率與腫瘤分期呈正相關(guān)。

Balla等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜母細胞瘤干細胞樣細胞表面表達CD44并廣泛參與細胞黏附和遷移等。而且在很多成人腫瘤如乳腺癌、腸癌、胰腺癌和頭頸部腫瘤中均顯示CD44是腫瘤干細胞標志物[9-12]。本研究結(jié)果顯示，CD44在腎母細胞瘤中的表達水平低于CD133，因此在腎母細胞瘤中CD44可能不是合適的腫瘤干細胞標志物。為明確CD133和CD44在腎母細胞瘤中是否可以作為腫瘤干細胞標志物，還需要進一步通過流式細胞術(shù)從腎母細胞瘤組織中分離CD133或CD44陽性細胞，并鑒定其體外生物學(xué)特征。

目前，已從多種兒童腫瘤中鑒定出腫瘤干細胞，但關(guān)于兒童腫瘤干細胞的知識相對有限。由于成人和兒童腫瘤干細胞在存在形式、功能和行為方面差異較大，需要找出特定的標志物來識別兒童腫瘤干細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，CD133可以作為兒童腎母細胞瘤的腫瘤干細胞標志物，其陽性率隨著晚期腫瘤分期的提高而增加，這意味著可以通過CD133靶向作用于腫瘤干細胞來治療兒童難治性或復(fù)發(fā)性腫瘤。