成 妍 焦彥生 喬 寧 苗如意

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西太原 030031）

近年來興起的CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR associated）體系是繼 ZFNs（Zinc-finger nucleases）（Urnov et al.，2010） 和 TALENs（transcription activator like effector nucleases）（Joung & Sander，2013）之后的第3代基因組編輯技術(shù)（Sanagala et al.，2017）。CRISPR是廣泛存在于細菌和古細菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列，由可俘獲的外源DNA組成，當含有同樣序列的外源DNA入侵時，可被細菌機體識別，并進行剪切使之表達沉默，達到保護自身安全的目的（Barrangou et al.，2007）。Cas蛋白存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在sgRNA（small guide RNA）引導(dǎo)下對靶位點進行切割（Jinek et al.，2012）。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成最為簡單，只需要1個Cas9蛋白就可切割DNA雙鏈，形成雙鏈DNA缺口（Mali et al.，2013）。然后細胞借助HR機制（homologous recombination） 或 者 NHEJ機 制（non-homologous end joining）對斷裂的DNA進行修復(fù)（Voytas，2013）。由于CRISPR/Cas9技術(shù)在載體構(gòu)建等方面比ZFNs和TALENs有許多優(yōu)勢，目前該技術(shù)已成功應(yīng)用在多種細菌、動物、植物和人類的基因編輯中（Nekrasov et al.，2013；Wang et al.，2013；Liu &Fan，2014；Liu et al.，2015；楊學(xué)飛 等，2017）。

八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，PSY）是植物類胡蘿卜素生物合成途徑中促進番茄紅素合成的上游關(guān)鍵酶，催化兩分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgerany pyrophosphate，GGPP）縮合形成八氫番茄紅素，目前已從番茄中分離得到 PSY 1（Fraser et al.，1999）和 PSY 2（Kato et al.，2004）2個編碼基因。PSY基因在番茄成熟過程中發(fā)揮著重要的作用。番茄作為蔬菜中模式植物，經(jīng)常被應(yīng)用于基因組遺傳操作的研究。英國諾丁漢大學(xué)植物科學(xué)系Graham Seymour實驗室一直致力于番茄果實成熟調(diào)控機制的研究（Liu et al.，2015；Uluisik et al.，2016），目前已完成番茄果實成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組測序，并對調(diào)控這一過程的關(guān)鍵基因進行了篩選，為了進一步研究這些基因的功能，對這些基因進行基因組水平編輯已成為必要。本試驗擬在此基礎(chǔ)上建立一種以CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的能夠穩(wěn)定敲除番茄基因的新方法，以期為番茄重要性狀相關(guān)基因功能鑒定提供依據(jù)，為構(gòu)建番茄果實成熟的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示果實成熟機制提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄材料AC++種子由英國諾丁漢大學(xué)植物科學(xué)系Graham Seymour教授提供。

所用載體、根癌農(nóng)桿菌、大腸桿菌感受態(tài)細胞均由英國諾丁漢大學(xué)植物科學(xué)系提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄PSY 1基因CRISPR/Cas9體系中sgRNA的合成 根據(jù)Mali等（2013）的方法在番茄PSY 1基因序列第1外顯子區(qū)尋找PAM基序和sgRNA序列，并根據(jù)sgRNA序列設(shè)計特異引物（F1：5′-TG TGGTCTCAATTGGCAGGCAGCCTTGGTGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3′；F2：5′-TGTGGTCTCA AGCGTAATGCCAACTTTGTAC-3′）。PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，包含 9.9 μL ddH2O，12.5 μL Q5 Master mix（QIAGEN），1.25 μL上游引物，1.25 μL下游引物，0.1 μL 載體 pICH86966：：AtU6p：：sgRNA_PDS（Addgene plasmid 46966）。進行35個循環(huán)的擴增，2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

圖1 番茄PSY 1基因CRISPR-Cas9 Level 1載體構(gòu)建圖解

1.2.2 CRISPR/Cas9 Level 1載體構(gòu)建 采用GenElutTMPCR Clean-Up Kit（SIGMA）進行sgRNA PCR產(chǎn) 物 純 化。4.4 μL純 化 產(chǎn) 物 與 0.3 μL pICSL01009：：AtU6p、0.3 μL pICH47751、1.0 μL 10 mmol·L-1ATP、1.0 μL T7buffer、1.0 μL Bsa I、1.0 μL T7ligase、1.0 μL Cut smart buffer混合進行CRISPR-Cas9 Level 1載體連接反應(yīng)（圖1）（Weber et al.，2011）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（DH8142）感受態(tài)細胞并克隆。用特異性引物（F1和F2）進行菌液PCR鑒定，2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。提取陽性菌液的質(zhì)粒DNA，送公司（Eurofins MWG Operon）測序。分析比對測序結(jié)果，檢測是否成功將雙鏈sgRNA連接到U6-sgRNA載體上。1.2.3 CRISPR/Cas9 Level 2載體構(gòu)建 取0.3 μL構(gòu)建好的 Level 1載體與 0.2 μL pICH47732： NPTⅡ、0.2 μL pICH47742： Cas9、0.3 μL pICH41766、1.0 μL pAGM4723、2.0 μL ddH2O、1.0 μL cut smart buffer、1.0 μL 10 mmol·L-1ATP、1.0 μL Bpi I、1.0 μL T7ligase、1.0 μL T7buffer混合進行CRISPRCas9 Level 2載體連接反應(yīng)（圖2）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（DH8142）感受態(tài)細胞并克隆。用特異性菌液PCR引物（F1和F2）進行PCR鑒定，2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。挑選3個陽性菌液提取質(zhì)粒DNA，測序。分析比對測序結(jié)果，檢測是否成功將雙鏈sgRNA連接到Cas9載體上。1.2.4 番茄CRISPR/Cas9/PSY 1 Level 2載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 搖菌10 mL（LB+Kanamycin），使其OD600約為1.5左右，然后依據(jù)PuriLink Quick Plasmid DNA Miniprep Kits（Invitrogen）提取連接了PSY 1-sgRNA的CRISPR-Cas9質(zhì)粒，使最終質(zhì)粒濃度大于100 ng·μL-1。取40 μL農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞與2 μL Level 2質(zhì)粒DNA混勻，并轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，在電轉(zhuǎn)儀上進行轉(zhuǎn)化（2.5 kV，400 Ω，25 μFD）。之后立即加入 1 mL預(yù)冷的LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到1 mL離心管中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 h。吸取100 μL培養(yǎng)液涂LB平板（含100 mg·L-1Kanamycin），28 ℃培養(yǎng)過夜。在LB平板上挑取白色單克隆到10 mL LB培養(yǎng)基中（含100 mg·L-1Kanamycin），28 ℃培養(yǎng)過夜。用特異性引物（F3：5′-GAAATTTAGATTGAAGCTGG-3′；F4：5′-GTGTTTTCAACTGGGTGTTC-3′）進行菌液 PCR鑒定，2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。菌液與50%的甘油混合，-80 ℃保存。

圖2 番茄PSY 1基因CRISPR-Cas9 Level 2載體構(gòu)建圖解

1.2.5 CRISPR/Cas9/PSY 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄子葉對番茄種子進行表面消毒，在MS培養(yǎng)基上播種，密度為3粒·cm-2。播種后10～12 d取子葉進行預(yù)培養(yǎng)24 h后，放入農(nóng)桿菌菌液中浸泡15 min，再放回到原來的培養(yǎng)基上26 ℃暗培養(yǎng)2 d。將子葉轉(zhuǎn)移到添加有80 mg·L-1Kanamycin和500 mg·L-1Carbenicilin的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每3～4周轉(zhuǎn)移1次子葉至新鮮的培養(yǎng)基中。當有小植株從愈傷組織中長出時，轉(zhuǎn)移至添加有0.87 mg·L-1IAA、80 mg·L-1Kanamycin和500 mg·L-1Carbenicilin的MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)。將生根良好的瓶苗栽植到基質(zhì)中。

1.2.6 突變檢測 利用DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）提取野生型和轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，并檢測濃度。以提取的基因組DNA為底物，用特異性引物（F3：5′-GAAATTTAGATTGAA GCTGG-3′；F4：5′-GTGTTTTCAACTGGGTGTTC-3′）檢測再生植株是否為轉(zhuǎn)基因植株。再對PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因的再生植株用特異性引物（F5：5′-TTGG TTTGCCTGTCTGTGGT-3′；F6：5′-TGTGTTTGTGCGC GTAACTG-3′）進行PCR擴增。然后用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測。采用GenElutTMPCR Clean-Up Kit（SIGMA）進行PCR產(chǎn)物純化。吸取15 μL純化的PCR產(chǎn)物送公司（Eurofins MWG Operon）測序，F(xiàn)5為測序引物。利用DNAMAN軟件將測序的結(jié)果與野生型進行比對，分析確定目的區(qū)間的突變情況。1.2.7 表型性狀鑒定 正常管理遺傳轉(zhuǎn)化植株，待其果實成熟時，觀察果皮顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄PSY 1基因CRISPR/Cas9體系中sgRNA的合成

理論上，用 pICH86966：：AtU6p：：sgRNA_PDS為模板擴增能合成174 bp的sgRNA（圖3）。本試驗利用特異引物擴增sgRNA獲得180 bp左右的PCR產(chǎn)物（圖4），與試驗設(shè)計理論結(jié)果一致。

2.2 CRISPR/Cas9 Level 1載體驗證

以Level 1載體菌液為模板，重復(fù)sgRNA PCR擴增反應(yīng)，同樣獲得180 bp左右的PCR產(chǎn)物（圖5），初步斷定sgRNA部分已經(jīng)整合到Level 1載體中?？寺y序結(jié)果進一步表明Level 1載體中包含有Bpi I酶切位點（ACTA和TTAC）、pU6、sgRNA骨架，且均沒有發(fā)生堿基突變。

2.3 CRISPR/Cas9 Level 2載體驗證

圖3 番茄PSY 1基因CRISPR-Cas9體系中的sgRNA序列

圖5 Level 1載體的擴增產(chǎn)物

以Level 2載體菌液為模板，重復(fù)sgRNA PCR擴增反應(yīng)，同樣獲得180 bp左右的PCR產(chǎn)物（圖3），初步斷定sgRNA部分已經(jīng)整合到Level 2載體中?？寺y序結(jié)果進一步表明Level 2載體中包含有NPT Ⅱ（圖6）、Cas9、sgRNA和L3E部分，且均沒有發(fā)生堿基突變。

圖6 Level 2載體的擴增產(chǎn)物

2.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的驗證

以轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液為模板，對Cas9部分序列進行PCR擴增反應(yīng)，獲得1 800 bp左右的PCR產(chǎn)物（圖7），斷定Level 2載體序列已經(jīng)整合到農(nóng)桿菌中。

圖7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的擴增產(chǎn)物

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的驗證

通過選擇培養(yǎng)基篩選具有Kanamycin和Carbenicilin抗性的再生植株，進行Cas9部分序列的PCR擴增反應(yīng)，能獲得1 800 bp左右的PCR產(chǎn)物。對這些再生植株進行目標區(qū)域PCR擴增反應(yīng)，獲得831 bp的PCR產(chǎn)物（圖8），測序后進行序列比對，發(fā)現(xiàn)36個轉(zhuǎn)基因植株中有22個（61%）PSY 1基因目標區(qū)出現(xiàn)不同數(shù)目的堿基缺失、增加或互換（表1）。待轉(zhuǎn)基因植株果實成熟時，發(fā)現(xiàn)PSY 1基因目標區(qū)堿基發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因植株果皮顏色由野生種的紅色變成了黃色或橙色（表1）。其中有14株在PSY 1基因目標區(qū)發(fā)生了堿基缺失，其果皮顏色全部表現(xiàn)為黃色。另外的8株在PSY 1基因目標區(qū)發(fā)生了堿基變異，顏色全部表現(xiàn)為橙色。表明定點敲除PSY 1基因使番茄果色發(fā)生了改變，驗證了PSY 1基因在番茄紅果色形成中的作用。

圖8 轉(zhuǎn)基因植株的特異引物擴增產(chǎn)物

表1 T0植株的序列比對和果色觀察結(jié)果

3 結(jié)論與討論

相對于ZFNs和TALENs這兩種目前研究較為成熟的打靶技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體更容易構(gòu)建（Voytas，2013）。利用ZFNs和TALENs進行基因定點突變，每1個位點需要構(gòu)建2個相應(yīng)的核酸酶，且步驟繁瑣，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對特異位點的識別僅靠sgRNA的引導(dǎo)（姚祝平 等，2017）。本試驗根據(jù)目標基因序列按照G（N）19NGG標準設(shè)計了sgRNA，僅通過兩步連接反應(yīng)就成功構(gòu)建了基因定點突變載體。更具優(yōu)勢的是，1個CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以由多個sgRNA組成，對應(yīng)不同的DNA識別位點，Cas9可以通用，因此構(gòu)建1個載體即可實現(xiàn)對多個不同位點的打靶（Cong et al.，2013）。而且針對每個特異位點的sgRNA只有幾十個堿基，整個載體較小，容易實現(xiàn)轉(zhuǎn)化（Wang et al.，2013）。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在sgRNA的引導(dǎo)下識別出特異的靶序列，且發(fā)現(xiàn)靶基因所在位點的雙鏈DNA都會被Cas蛋白中的核酸內(nèi)切酶剪切，實現(xiàn)RNA指導(dǎo)的DNA沉默（Liu et al.，2015）。Brooks等（2014）通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點突變驗證了SlAGO7基因在番茄中的作用，并證明了番茄中由CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的SlAGO7基因突變是高效的。蒲艷等（2018）基于S1U6啟動子的CRISPR/Cas9基因組編輯載體，在番茄中成功實現(xiàn)對內(nèi)源基因的編輯。本試驗中有61%的轉(zhuǎn)基因植株實現(xiàn)了PSY 1基因的定點敲除，使番茄果色發(fā)生了改變，再次證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在番茄基因敲除中的高效性。

但由于sgRNA與靶位點DNA配對時存在種子序列，產(chǎn)生不嚴謹配對，在整個遺傳操作過程中還是會有脫靶現(xiàn)象（Kleinstiver et al.，2015）。在本試驗中也有39%的再生植株在PCR檢測中表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株，但對目標區(qū)域進行序列測定后發(fā)現(xiàn)沒有發(fā)生序列改變。通過改變sgRNA的二級結(jié)構(gòu)、改變sgRNA的長度、通過互補的切口酶預(yù)先制造雙鏈DNA斷裂，均有效降低了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶率（Doench et al.，2014；Kleinstiver et al.，2016），但這些技術(shù)在具體應(yīng)用中的效果還需進一步證實。

本試驗通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功編輯了番茄PSY 1基因，所有變異均發(fā)生在試驗設(shè)計的PSY 1基因第1外顯子區(qū)的目標區(qū)域，使PSY 1基因失去了功能。試驗中發(fā)生堿基缺失的果實表現(xiàn)為黃色，說明這些果實中沒有番茄紅素，PSY 1基因徹底失去了功能，呈現(xiàn)出少量胡蘿卜素的黃色；而發(fā)生堿基變異的果實都表現(xiàn)為橙色，說明這些果實中還含有少量的番茄紅素，與胡蘿卜素共存，呈現(xiàn)為橙色。這些少量的番茄紅素是如何合成的，則需要對橙色轉(zhuǎn)基因番茄做一步的研究。