齊云峰 霍如婕 劉岱

[摘要]目的 探討維生素D（Vitamin D，VD）對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（RLE-6TN）間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法 體外培養(yǎng)RLE-6TN細(xì)胞，分為正常對照組（A組）、TGF-β1組（B組）、TGF-β1+VD組（C組）、TGF-β1+ICG001組（D組）、TGF-β1+VD+ICG001組（E組），分別用VD或（及）ICG001預(yù)處理細(xì)胞，24 h后再加入TGF-β1， 48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，采用Western blot檢測E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和纖維連接蛋白（Fn）的表達(dá)。結(jié)果 鏡下A組細(xì)胞貼壁生長，呈鋪路石樣，連接緊密；B組間隙明顯增大，顯著梭形變；C組、D組較B組細(xì)胞更多地呈鋪路石樣改變，細(xì)胞間隙有所縮?。籈組細(xì)胞則大多呈鋪路石樣改變，間隙更小，形態(tài)接近正常組。Western blot檢測顯示，B、C、D、E組的α-SMA、Fn表達(dá)量均高于A組，而E-cadherin表達(dá)量均低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D、E組的α-SMA、Fn表達(dá)量低于B組，而E-cadherin表達(dá)量高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D組的α-SMA、Fn表達(dá)量高于E組，而E-cadherin表達(dá)量低于E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D兩組的α-SMA、Fn及E-cadherin表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 VD可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

[關(guān)鍵詞]維生素D；TGF-β1；ICG001；間質(zhì)轉(zhuǎn)化

[中圖分類號] R33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）7（a）-0004-04

[Abstract]Objective To investigate the influence of vitamin D （VD） on the mesenchymal transformation of alveolar Ⅱ epithelial cells （RLE-6TN） induced by TGF-β1 in rats.Methods RLE-6TN cells were cultured in vitro，and were divided into the control group （group A），the TGF-β1 group （group B），the TGF-β1+VD group （group C），the TGF-β1+ICG001 group （group D），the TGF-β1+VD+ICG001 group （group E）.The cells were treated with VD and/or VD+ICG001 at first，and TGF-β1 was added into the culture solution after 24 h，the Western blot was used to detected the α-SMA，F(xiàn)ibronectin （Fn） and E-cadherin protein levels after 48 h.Results Under the microscope，in group A，cells adhered to the wall and showed a paving stone with tight junctions.The gap in group B was significantly increased and the spindle was obviously deformed.The cells in groups C and group D showed more paving stone-like changes than those in group B，and the cells gap decreased.Most of the cells in the group E were mostly paved stone-like changes，the gap was smallest and morphology was close to the normal group.Western blot analysis showed that the expression levels of α-SMA and Fn in groupB，C，D，E were higher than that in group A，but the expression of E-cadherin was lower than that in group A，the differences were statistically significant （P<0.05）.The levels of α-SMA and Fn in group C，D，E were lower than that in group B，but the expression of E-cadherin was higher than that in group B，the differences were statistically significant （P<0.05）.The expression levels of α-SMA and Fn in group C and group D were higher than that in group E，but the expression of E-cadherin was lower than that in group E，and the differences were statistically significant （P<0.05）.There were no significant differences in the expression levels of α-SMA，F(xiàn)n and E-cadherin between group C and group D （P>0.05）.Conclusion Vitamin D can inhibited the mesenchymal transition of alveolar Ⅱ epithelial cells induced by TGF-β1 in rats.

[Key words]Vitamin D；TGF-β1；ICG001；Mesenchymal transition

氣道重塑是呼吸系統(tǒng)慢性疾病如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、哮喘等長期反復(fù)發(fā)作出現(xiàn)的病理過程。長期反復(fù)的炎癥刺激，會導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞損傷，使其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究顯示，TGF-β被認(rèn)為是促使肺上皮細(xì)胞間質(zhì)化的關(guān)鍵因子[1-2]，而β-catenin是TGF-β1發(fā)揮作用的重要途徑。在腎臟上皮細(xì)胞采用ICG001特異性地阻斷β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3]。目前，維生素D（Vitamin D，VD）被認(rèn)為可改善氣道平滑肌增生、杯狀細(xì)胞增生、上皮下纖維化等氣道結(jié)構(gòu)功能的作用，從而改善呼吸系統(tǒng)慢性疾病的氣道重塑[4]。氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)1α-羥化酶和VD受體，可將無活性的VD轉(zhuǎn)化為有生理活性的VD[5-6]。Hlaing等[7]的研究顯示，在心肌細(xì)胞中VD可以負(fù)向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，抑制心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌細(xì)胞分化，但VD是否通過β-catenin信號通路來調(diào)控大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化尚未見報道。本研究通過VD或（及）ICG001預(yù)處理RLE-6TN細(xì)胞，再用TGF-β1刺激，觀察RLE-6TN細(xì)胞形態(tài)的變化以及檢測上皮、間質(zhì)化特征性蛋白的表達(dá)，旨在探討VD對大鼠肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系RLE-6TN細(xì)胞（上海拜力生物科技有限公司）。

1.2主要儀器與試劑

恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（江蘇榮華有限公司）；GelDOXR全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Western blot用電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）；胎牛血清（中國杭州四季青）；高糖DMEM培養(yǎng)基（武漢博士德生物工程有限公司）；0.25%胰蛋白酶（武漢博士德生物工程有限公司）；Vitamin D（上海生工生物科技有限公司）；ICG001（上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司）；TGF-β1（美國peprotech公司）；E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和纖維連接蛋白（Fn）兔抗大鼠一抗（中國南京巴傲得生物科技有限公司）；增強(qiáng)型RIPA蛋白質(zhì)裂解液及FITC標(biāo)志的羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.3.1 RLE-6TN細(xì)胞的培養(yǎng) 將RLE-6TN細(xì)胞置于含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%的CO2孵育箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，細(xì)胞呈鋪路石樣貼壁生長。

1.3.2細(xì)胞分組及處理 將各組細(xì)胞按1×105個/ml的密度種到6孔板中，分為正常對照組（A組）、TGF-β1組（B組）、TGF-β1+VD組（C組）、TGF-β1+ICG001組（D組）、TGF-β1+VD+ICG001組（E組）。參考文獻(xiàn)濃度，先加入VD（1 μmol/L）[8]或（及）ICG001（5 μmol/L）[9]，24 h后在培養(yǎng)液中加入TGF-β1（10 ng/ml）[8]，誘導(dǎo)48 h后采用Western blot法檢測目的蛋白表達(dá)。

1.4觀察指標(biāo)及檢測方法

熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。采用Western blot法檢測各組細(xì)胞α-SMA、Fn及E-cadherin的表達(dá)量。使用增強(qiáng)型RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，10%的SDS-PAG分離細(xì)胞總蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，一抗1︰1000稀釋抗α-SMA、Fn及E-cadherin抗體，二抗1︰6000稀釋，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各目的蛋白灰度值，并以內(nèi)參β-actin標(biāo)化各樣品蛋白條帶的灰度數(shù)值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用LSD多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下，A組細(xì)胞貼壁生長，呈鋪路石樣，連接緊密；B組間隙明顯增大，顯著梭形變；C組、D組較B組細(xì)胞更多地呈鋪路石樣改變，細(xì)胞間隙有所縮??；E組細(xì)胞則大多呈鋪路石樣改變，間隙更小，形態(tài)最為接近A組（圖1）。

2.2各組細(xì)胞α-SMA、Fn及E-cadherin表達(dá)量的比較

B、C、D、E組的α-SMA、Fn表達(dá)量均高于A組，而E-cadherin表達(dá)量低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D、E組的α-SMA、Fn表達(dá)量低于B組，而E-cadherin表達(dá)量高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D組的α-SMA、Fn表達(dá)量高于E組，而E-cadherin表達(dá)量低于E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D兩組的α-SMA、Fn及E-cadherin表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖2、圖3）。

3討論

氣道重塑包括上皮異常增生，氣道平滑肌細(xì)胞增生、肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積等過程[10-11]，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在氣道重塑的過程中扮演著重要角色。TGF-β1在氣道重塑過程中發(fā)揮著核心效應(yīng)分子的作用[12]，其作用的途徑包括β-catenin、經(jīng)典的Smad和非Smad通路等，其中β-catenin通路與疾病的纖維化形成密切相關(guān)[13]。TGF-β1刺激破壞細(xì)胞間的緊密連接，誘導(dǎo)β-catenin從上皮細(xì)胞接觸中解離，使β-catenin的降解減少，從而核內(nèi)β-catenin/TGF結(jié)合增多，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞分化及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14-15]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染F-TrCP-Ecad質(zhì)粒，靶向降解胞漿β-catenin蛋白，或采用ICG001特異性地阻斷β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果均顯示其可以明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3]。研究顯示，VD缺乏在成人及兒童（5～13歲）哮喘患者中普遍存在，在重癥及未控制患者中尤為顯著，而低水平血清VD（<50 nmol/L）會增加青少年及成人患哮喘的風(fēng)險，且VD缺乏與氣流受限有關(guān)[16-18]。對心肌細(xì)胞的研究顯示，補(bǔ)充VD可以使Wnt11和CK1蛋白表達(dá)增高，負(fù)向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，達(dá)到抑制心肌細(xì)胞增殖、分化及重塑的效果[7]，但VD是否通過β-catenin信號通路來調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化尚未見報道。

本實(shí)驗(yàn)采用VD或（及）ICG001預(yù)處理RLE-6TN細(xì)胞，后用TGF-β1刺激，研究觀察對RLE-6TN細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。鏡下TGF-β1刺激組細(xì)胞形態(tài)上明顯呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特征，顯著梭形變，間隙明顯增大。但單用VD或ICG001預(yù)處理組細(xì)胞較TGF-β1刺激組則更多地呈鋪路石樣改變，細(xì)胞間隙有所變小，而VD+ICG001預(yù)處理組尤為明顯，接近正常組，細(xì)胞連接最為緊密，提示VD或（及）ICG001干預(yù)可以抑制RLE-6TN細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化。采用Western blot檢測相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，VD能夠降低TGF-β1刺激組細(xì)胞的間葉細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA以及細(xì)胞外基質(zhì)纖粘蛋白Fn的表達(dá)，同時上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，預(yù)處理組中VD+ICG001（E組）比單用VD（C組）或ICG001（D組）的效果更明顯，結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。上述結(jié)果提示VD能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)下RLE-6TN細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而對纖維化形成產(chǎn)生影響。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VD能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時VD與ICG001聯(lián)合干預(yù)顯示出更強(qiáng)的抑制大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)化的作用。其機(jī)制可能在于VD負(fù)向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制β-catenin/TGF啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄，與ICG001發(fā)揮協(xié)同作用，起到抗纖維化的效應(yīng)。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，能夠?yàn)榕R床探索改善氣道重塑性疾病的藥物治療提供新思路。

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（收稿日期：2018-03-08 本文編輯：祁海文）