陳美意，王逸琦，狄春紅，洪 玉，王 靖，金樂紅，譚曉華

(1.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310036； 2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科，浙江 杭州 310015)

砷是自然界廣泛存在的一種有毒的類金屬元素[1]，是確定的一類致癌物，可導(dǎo)致肝、肺等多種組織的癌癥，還與糖尿病、心腦血管疾病等相關(guān)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，砷是細(xì)顆粒物PM2.5的重要成分[4-5]。砷微核試驗是化學(xué)毒物或物理因素?fù)p傷染色體、干擾細(xì)胞有絲分裂的快速檢測方法。微核是間期細(xì)胞中染色體畸變的一種表現(xiàn)形式，在各種理化因子，如輻射、化學(xué)藥劑作用下產(chǎn)生的染色單體的無著絲粒斷片或因紡錘絲受損而丟失的整個染色體，不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞, 在細(xì)胞質(zhì)中形成一個或幾個規(guī)則的次核。本研究采用小鼠骨髓微核法檢測亞砷酸鈉對微核形成的影響，為研究亞砷酸鈉(NaAsO2)的遺傳毒性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 NaAsO2(美國sigma公司)用生理鹽水配制為0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL 各濃度的溶液，環(huán)磷酰胺(天津金世制藥有限公司)用生理鹽水配制濃度為4 mg/mL的溶液。

1.2 小鼠分組及處理 選用昆明種成年小鼠，雌雄小鼠各隨機分為6 組，每組8只。采用等容量法灌胃給藥，每20 g體重小鼠灌胃0.5 mL藥物。以環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)100 mg/kg劑量組為陽性對照，以生理鹽水處理組為陰性對照。小鼠經(jīng)口LD50亞砷酸鈉為50 mg/kg[6]，亞砷酸鈉處理各組劑量分別為1.5625，3.125，6.25，12.5 mg/kg，共灌胃2次，每次間隔24 h。

1.3 股骨骨髓細(xì)胞涂片制備 于第二次灌胃6 h后處死小鼠，剝離股骨，剪除兩端骨垢。每只小鼠用0.5 mL胎牛血清沖洗股骨骨髓至離心管中，800 rpm離心5 min收集骨髓細(xì)胞。吹勻后用槍頭吸取少量骨髓細(xì)胞滴至載玻片一端1/3處上，取另一張載玻片邊緣置于骨髓細(xì)胞上呈30°角，迅速推片，在酒精燈上烤干后將載玻片置于甲醇中固定15 min，晾干后于新鮮配置的吉姆薩染液中染色20 min，取出后清水沖洗掉多余染液并晾干。

1.4 鏡檢觀察計數(shù) 油鏡下觀察計數(shù)，嗜多染紅細(xì)胞(PCE)呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞(NCE)細(xì)胞呈橘黃色。計數(shù)1000個PCE，計算嗜多染紅細(xì)胞微核率(micronucleus frequency，MN‰)；計數(shù)200個紅細(xì)胞，計算PCE/NCE比值。選取兩名有經(jīng)驗成員進(jìn)行平行計數(shù)，取其平均數(shù)，如數(shù)值差距較大則轉(zhuǎn)換視野重新計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠骨髓PCE微核率的影響 微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小為主核的1/20～1/4(圖1)。與生理鹽水灌胃的陰性對照組比較，雌、雄性小鼠亞砷酸鈉各處理組的骨髓PCE細(xì)胞微核率均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且微核率隨著砷濃度的增加而增加，呈劑量依賴效應(yīng)。雌性小鼠12.5 mg/kg NaAsO2劑量組微核率為14.02±3.20‰，100 mg/kg CTX陽性對照組的微核率為14.89±0.70‰，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雄性小鼠12.5 mg/kg NaAsO2組微核率為14.25±0.60‰，100 mg/kg CTX陽性對照組的微核率為15.49±0.80‰，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。亞砷酸鈉同劑量組間的雌、雄小鼠間微核率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 微核細(xì)胞(箭頭所示)(×100)

注：A. 雄性小鼠；B. 雌性小鼠；與生理鹽水組比較，*P<0.05；** P<0.01。圖2 亞砷酸鈉對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響

2.2 對小鼠PCE/NCE比值的影響 雌、雄性小鼠各亞砷酸鈉劑量處理組的PCE/NCE比值與生理鹽水陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；相同處理雌、雄小鼠間PCE/NCE比值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。100 mg/kg CTX陽性對照組的雌性小鼠PCE/NCE比值和雄性小鼠PCE/NCE比值均低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

注：*與同性別生理鹽水組比較，P<0.05。圖3 亞砷酸鈉砷對小鼠骨髓PCE/NCE比值的影響

3 討論

微核是指存在于細(xì)胞中主核之外的一種核酸顆粒，是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲功能受影響在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。微核可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區(qū)別。骨髓中成紅細(xì)胞分化為紅細(xì)胞的過程中，主核排出成為PCE，細(xì)胞保持其堿性約24 h，然后成為NCE。因此計數(shù)PCE細(xì)胞中微核可以排除主核的干擾，計數(shù)更為準(zhǔn)確。Banerjee等[7]使用瑞士白化鼠為動物模型，檢測到1.6 mg/kg三氧化二砷(As2O3)處理組小鼠骨髓PCE細(xì)胞微核率約為5‰。另有研究表明，砷可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞微核率增加[8]。體外微核實驗發(fā)現(xiàn)，砷可以誘導(dǎo)人淋巴微核率的增加[9]。國外的流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，砷暴露人群的微核率增加[10]，但國內(nèi)未見相關(guān)報道。PCE為未成熟的紅細(xì)胞，而NCE為成熟紅細(xì)胞，PCE/NCE比值可以反映骨髓造血抑制情況，如比值<0.1，表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制。本研究以昆明種成年小鼠為動物模型，檢測了不同濃度NaAsO2對小鼠微核率的影響，在劑量選擇上參考魏建宏[6]的研究報道。結(jié)果顯示，1.5625～12.5 mg/kg劑量范圍內(nèi)的NaAsO2能夠顯

著增加雌、雄性小鼠骨髓PCE細(xì)胞的微核率，呈劑量依賴效應(yīng)。雌、雄性小鼠各亞砷酸鈉劑量處理組的PCE/NCE比值與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果提示亞砷酸鈉具有較強的促微核形成能力，12.5mg/kg NaAsO2劑量組的微核率與100 mg/kg CTX陽性對照組接近。

綜上，亞砷酸鈉具有較強的遺傳毒性，但其誘導(dǎo)產(chǎn)生微核的機制尚需進(jìn)一步研究。