伍仙　何樹光　劉靈芝

[摘要] 目的 分析梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）Hsp40蛋白的生物學(xué)特性并克隆其基因。 方法 通過(guò)GenBank查到Hsp40蛋白的序列，利用生物信息學(xué)軟件分析其生物學(xué)特性。根據(jù)Tp Hsp40基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR擴(kuò)增Hsp40基因，并把該DNA片段連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽(yáng)性克隆采用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 Tp Hsp40基因能夠編碼374個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其分子量為40.1 kDa，無(wú)信號(hào)肽，呈親水性。Swissmodel 預(yù)測(cè)得到Tp Hsp40的三級(jí)結(jié)構(gòu)與嗜熱桿菌（Thermus thermophilus）Hsp40結(jié)構(gòu)最接近。從Tp基因組中擴(kuò)增得到1125 bp的Tp Hsp40基因并將其連接到pMD19-T載體。 結(jié)論 本文預(yù)測(cè)了梅毒螺旋體毒力因子Hsp40蛋白的結(jié)構(gòu)和克隆得到Tp Hsp40基因。

[關(guān)鍵詞] 梅毒螺旋體；Hsp40蛋白；生物信息學(xué)；基因克隆

[中圖分類號(hào)] R377 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）20-0041-03

Bioinformatical analysis and gene clone of treponema pallidum Hsp40

WU Xian HE Shuguang LIU Lingzhi CHEN Chaoying ZHU Yixi MO Zuoqun

Clinical Laboratory， First Affiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College， Zhuzhou 412000， China

[Abstract] Objective To investigate the biological characteristics of treponema pallidum （Tp） Hsp 40 and clone its gene. Methods Protein sequence of Hsp40 was found using GenBank and its biological characteristics were analyzed using bioinformatical software. Specific primer was designed based on the genetic sequence of Tp Hsp40 and PCR was used to amplify the gene of Hsp40. The DNA fragment was ligated to pMD19-T carrier and transformed to Escherichia coli. Positive clones were selected to be verified using PCR and DNA sequencing. Results Gene of Tp Hsp40 could encode a protein of 374 amino acids. The molecular weight of the protein was 40.1 kDa. The protein had no signal peptide and was hydrophilic. The tertiary structure of Tp Hsp40 predicted by Swissmodel was closest to the structure of thermus thermophilus Hsp40. Gene of Tp Hsp40 with 1125bp amplified from genome of Tp was ligated to pMD19-T carrier. Conclusion This paper predicted the structure of Hsp40， the virulence factor of Tp， and cloned the gene of Tp Hsp40.

[Key words] Treponema pallidum； Hsp40； Bioinformatics； Gene clone

梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）是引起梅毒的病原體。研究發(fā)現(xiàn)Tp能夠感染并破壞成人多種器官，能經(jīng)胎盤傳入胎兒導(dǎo)致先天梅毒，嚴(yán)重者會(huì)產(chǎn)生死胎和流產(chǎn)[1，2]。目前我國(guó)梅毒患者數(shù)量呈增加趨勢(shì)，僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核，在法定甲乙類傳染病中排第三位[3-4]。如何有效預(yù)防及控制梅毒已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。在Tp中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素等傳統(tǒng)的毒力蛋白，但是通過(guò)基因工程獲得Tp鞭毛蛋白、鐵蛋白TpF1、外膜蛋白和趨化蛋白在體外能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，提示這些蛋白可能是Tp致病中的關(guān)鍵蛋白[5-9]。尋找Tp新的毒力蛋白是研究其致病機(jī)制的關(guān)鍵[9]。熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是一組具有保守結(jié)構(gòu)域的蛋白超家族。在細(xì)菌受到應(yīng)激和脅迫時(shí)大量表達(dá)，幫助細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境。最近發(fā)現(xiàn)Hsp40蛋白在細(xì)菌致病過(guò)程中可能發(fā)揮重要功能[10-13]。我們?cè)赥p的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Hsp40同源蛋白，本實(shí)驗(yàn)擬采用生物信息學(xué)方法分析Hsp40蛋白的生物學(xué)特性并克隆得到Hsp40基因，為研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和載體

梅毒螺旋體和大腸埃希菌Top10由湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科保存，克隆載體pMD19-T來(lái)自寶生物工程（大連）公司。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶，高保真 DNA聚合酶，DNA marker，限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII和DNA膠回收試劑盒從寶生物工程（大連）公司購(gòu)買，細(xì)菌DNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.3 Hsp40生物信息學(xué)分析

從GenBank中獲取梅毒螺旋體（T.pallidum，accession number：NZ_CP003679）的Hsp40基因和蛋白序列。利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化特性，采用ProtScale預(yù)測(cè)其親水性，采用Swiss-model預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 Tp Hsp40基因的PCR擴(kuò)增

依據(jù)Tp Hsp40基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物。Hsp40-F：5-AGCCATATGGTGGCAAAGAAGGATTATTA-3；和Hsp40-R：5-CCCAAGCTTCTACTTGAGACTTG-AAA-3。然后由賽默飛世爾科技公司（廣州）進(jìn)行合成。以提取的梅毒螺旋體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增Hsp40基因片段。PCR體系：5 μL 10×PCR 緩沖液，1 μL引物 Hsp40-F（10 μM），1 μL引物Hsp40-R （10 μM），0.1 μg模板Tp DNA，1 μL DNA聚合酶（2.5 U/μL），1 μL dNTP Mixture（10 mM），最后加入無(wú)菌水到50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 2 min；（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）×30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 5 min。得到的DNA片段進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行回收。

1.5 pMD19-Hsp40質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將回收的Hsp40片段與pMD19-T載體相連，獲得pMD19-Hsp40重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Top10，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后使用PCR鑒定，將陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SignalP4.1軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明Hsp40蛋白無(wú)信號(hào)肽，使用ProtScale軟件預(yù)測(cè)Hsp40蛋白的親疏水性，使用在線軟件Swissmodel模擬Tp Hsp40蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 Tp Hsp40理化特性

利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化性質(zhì)，Hsp40蛋白全長(zhǎng)含有374個(gè)氨基酸，分子量為40.1 kDa，等電點(diǎn)為8.75。不穩(wěn)定指數(shù)為38.44，表明Hsp40蛋白不容易降解。SignalP4.1軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明Hsp40蛋白無(wú)信號(hào)肽，定位在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)。見封三圖3。

使用ProtScale軟件預(yù)測(cè)Hsp40蛋白的親疏水性，其中得分負(fù)數(shù)的區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū)域，得分為正的區(qū)域?yàn)橛H水性區(qū)域，Hsp40的親疏水區(qū)域分散較開，總體呈親水性。見封三圖4。

2.2 Hsp40蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

使用在線軟件Swissmodel模擬Tp Hsp40蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與嗜熱桿菌（Thermus thermophilus）Hsp40蛋白（PDB：4j80.1）的結(jié)構(gòu)最為接近，獲得結(jié)構(gòu)見封三圖5。

2.3 Hsp40基因的克隆

以Tp DNA為模板PCR擴(kuò)增Hsp40基因，然后進(jìn)行電泳，DNA大小約為1150 bp左右（封三圖6A）。將目的片段與pMD19-T相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR驗(yàn)證陽(yáng)性（封三圖6B）再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證明成功克隆到Hsp40基因。

3 討論

梅毒是由Tp感染并嚴(yán)重危害人類身心健康的一種性傳播疾病，臨床上可以分為Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期及先天梅毒等。Tp具有極強(qiáng)的侵襲力，進(jìn)入患者體內(nèi)后能夠通過(guò)血液快速擴(kuò)散到全身。Tp感染具有極強(qiáng)的隱蔽性，全球梅毒患者數(shù)量極高、傳染性極強(qiáng)，如何有效控制和預(yù)防梅毒已成為全球普遍關(guān)注的社會(huì)和健康問(wèn)題[2-4]。目前還不能夠在體外培養(yǎng)Tp，只能夠?qū)⑵浣臃N到兔子睪丸，然后增殖。目前沒(méi)有辦法對(duì)Tp進(jìn)行基因敲除，故也無(wú)法判斷那些蛋白在梅毒致病過(guò)程中發(fā)揮作用。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)梅毒的外膜蛋白、鐵蛋白、纖連蛋白和鞭毛蛋白等能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌炎癥因子，推測(cè)患者感染Tp后，這些蛋白可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致宿主損傷[5-8]。尋找新的Tp毒力蛋白是目前Tp研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，闡明這些毒力蛋白的作用機(jī)制有助于預(yù)防和控制梅毒的傳播。

Hsp蛋白是一組廣泛存在于真核和原核生物中受應(yīng)激誘導(dǎo)的高度保守蛋白，它又稱為伴侶蛋白。按照分子量的不同，Hsp蛋白可Hsp10，40，60或70等。Hsp40蛋白又稱為DnaJ蛋白，它除了作為分子伴侶外還具有多種功能。特別是近些年發(fā)現(xiàn)Hsp40蛋白在先天性免疫中具有重要作用。研究已證實(shí)肺炎鏈球菌Hsp40蛋白可保護(hù)小鼠免受肺炎鏈球菌的損害[10-12]。免疫肺炎鏈球菌和傷寒沙門氏桿菌Hsp40蛋白后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫性保護(hù)功能，減輕肺炎鏈球菌和傷寒沙門氏桿菌的入侵[11-13]。肺炎鏈球菌Hsp40基因缺陷可降低肺炎感染模型小鼠的炎癥反應(yīng)、促炎因子分泌及胞內(nèi)信號(hào)分子的激活，研究證實(shí)Hsp40蛋白能夠通過(guò)TLR4受體，活化MAPK、PI3K-Akt和NF-κB等多條途徑，激活DC細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞參與細(xì)胞免疫，接種Hsp40蛋白可以預(yù)防肺炎鏈球菌的感染。肺炎鏈球菌Hsp40蛋白能夠活化巨噬細(xì)胞，從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[12-15]。

此外梅毒感染后的致病周期也較長(zhǎng)，并且不同期的梅毒的臨床癥狀也不一樣，采取的治療手段也有區(qū)別，目前所用的診斷方法也不能夠精確判定。分期主要還是依靠患者的臨床癥狀，目前臨床患者數(shù)量多，使得在上報(bào)梅毒疫情上存在一定困難[3]，因此急需開發(fā)新的梅毒分期標(biāo)志?，F(xiàn)在采用基因工程的手段表達(dá)了Tp的抗原，這些抗原同樣具有活性，并能用作臨床診斷[16-17]。本文通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了Tp Hsp40蛋白的分子量，親疏水性和三級(jí)結(jié)構(gòu)等生物學(xué)特性，同時(shí)克隆獲得了Tp Hsp40基因。我們預(yù)測(cè)Tp Hsp40蛋白可能與肺炎鏈球菌等Hsp40蛋白具有類似功能，能夠在促進(jìn)分泌炎癥因子中起作用，可能是Tp的一個(gè)毒力蛋白。目前還沒(méi)有特異預(yù)防Tp感染的疫苗，為此我們也推測(cè)Tp Hsp40分子可能與肺炎鏈球菌、傷寒沙門氏桿菌等的Hsp40分子具有類似的功能，能夠誘導(dǎo)人體對(duì)Tp產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而減少Tp的感染。此外我們還打算進(jìn)一步分析Hsp40蛋白在梅毒的治療和檢測(cè)方面是否具有一定的作用。

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（收稿日期：2018-01-09）