王 辰， 秦麗微， 秦麗紅， 關(guān)雪蓮， 石 磊， 王秀萍， 侯麗淳

在急性缺血性腦血管疾病中，炎癥免疫反應(yīng)在發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用。在炎性反應(yīng)所致腦損傷的過程中會(huì)有炎癥細(xì)胞的增加、細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞間黏附分子表達(dá)增加等反應(yīng)。先天性免疫系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷中有著重要的作用,是由TLR家族直接介導(dǎo)的[1]。在TLR成員中,與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)系較為密切是TLR4。因此,本研究通過檢測(cè)急性腦梗死患者外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)，用ELISA法測(cè)定血清TNF-α、IL-6 的濃度,探討TLR4在急性缺血性腦血管疾病中炎性損傷作用，為今后在臨床上治療急性腦梗死提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象的選取 收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科發(fā)病第3天急性腦梗死患者60例。收錄所有患者均符合1995年全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn),并且為CT或MRI所證實(shí)。為避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，有下列情況之一者會(huì)被排除：(1)正在使用激素或一個(gè)月內(nèi)使用過；(2)急性肝缺血病變；(3)急性心機(jī)缺血病變；(4)結(jié)締組織病者；(5)2 w以內(nèi)發(fā)生感染性疾病者；(6)不能按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)完成指標(biāo)采集者；收集腦動(dòng)脈粥樣硬化患者50例作動(dòng)脈粥樣硬化組，所有病例均經(jīng)過頸部彩色多普勒檢查所證實(shí)；同時(shí)期收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康體檢者50例作為正常對(duì)照組；3組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有入組人群經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集及處理 取靜脈血之前需禁食12 h以上，空腹清晨時(shí)采取靜脈血10 ml，以乙二胺四乙酸二鉀鹽抗凝。8 ml樣品以每分鐘250 g離心5 min，吸出血漿后加入等量的0.9%氯化鈉，混均勻，選用聚蔗糖-泛影葡胺液(Ficoll分層液)分離得到單核細(xì)胞，余2 ml室溫下凝固后分離血清，零下25 ℃下冷凍備用。

1.3 RT-PCR 采用Trizol一步法提取外周血單核細(xì)胞內(nèi)總RNA，取樣品細(xì)胞,加TRLzol 500～750 μl，裂解細(xì)胞,并保護(hù)RNA防止降解，室溫下用注射器將裂解液反復(fù)抽提30次，將細(xì)胞充分搗碎后,靜置5～10 min。加入200 μl氯甲烷，劇烈震蕩15 s。靜置5～10 min，萃取裂解液中的RNA，1200 r/min離心15 min，吸取水相250 μl，加等量的異丙醇混勻，靜置5 min，濃縮沉淀RNA，1200 r/min離心15 min，棄上清，即提到了細(xì)胞內(nèi)總RNA。然后經(jīng)脫氧核糖核酸酶I(DNaseⅠ)處理。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)我們按照試劑盒說明書進(jìn)行。TLR4 引物設(shè)計(jì)，上游引物為：5’TGG ATA CGT TTC TTA TAA 3’；下游為：5’GAA ATG GAG GCA CCC CTT 3’。采用上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)的內(nèi)參β-actin，上游引物為：5’GGG ACC TGA CTG ACT ACC TCA3’；下游引物為：5’CAA GAA AGG GTG TAA CGC AAC3’。TLR4 與內(nèi)參β-actin同管擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，54.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸10 min。

1.4 血清IL-6、TNF-α濃度測(cè)定 實(shí)驗(yàn)室采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。分別按照TNF-α、IL-6試劑盒上的說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 TLR4 mRNA表達(dá)、血清TNF-α和IL-6濃度 TLR4 mRNA表達(dá)在急性腦梗死組為(1.35±0.23)、動(dòng)脈硬化組為(0.52±0.18)、正常對(duì)照組為(0.21±0.09)，急性腦梗死組明顯高于動(dòng)脈硬化組(P<0.01)，后者又高于正常對(duì)照組(P<0.01)；急性腦梗死組血清TNF-α濃度為(51.81±7.51)、IL-6濃度為(198.75±26.51)，均明顯高于動(dòng)脈硬化組和對(duì)照組(P<0.01)(見表1)。

2.2 相關(guān)性分析 急性腦梗死組單核細(xì)胞TLR4 mRNA 表達(dá)與血清濃度TNF-α呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.781(P<0.01)，TLR4 m RNA 表達(dá)與血清濃度IL-6呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù) 0.831(P<0.01)。

表1 3組TLR4 mRNA表達(dá)水平，血清 TNF-α和IL-6濃度

與動(dòng)脈粥樣硬化組比較#P<0.01；與正常對(duì)照組比較*P<0.01

3 討 論

腦梗死發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,目前也不是完全清楚，既往我們認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)是免疫反應(yīng)豁免器官,但現(xiàn)在逐漸認(rèn)識(shí)到在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)也同樣存在免疫監(jiān)視。炎癥免疫反應(yīng)存在于腦梗死壞死及缺血區(qū)域,導(dǎo)致炎性損傷，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[2,3]。作為啟動(dòng)機(jī)體先天性免疫應(yīng)答的開關(guān),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。在TLR成員中,TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用,小膠質(zhì)細(xì)胞則是損傷介質(zhì)的主要來源[4]。TLR4廣泛分布在腦室周圍血管叢、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞[5]。而腦缺血病理損傷中小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞是炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要來源。TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但在腦梗死炎癥損傷中的作用機(jī)制目前尚不明了，目前在腦梗死炎癥損傷中的作用機(jī)制卻報(bào)道不多。炎性反應(yīng)是神經(jīng)元毒性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腦梗死后第3天,在腦梗死缺血區(qū)域達(dá)到高峰[6]。因此我們選擇了發(fā)病3 d的腦梗死患者作為研究對(duì)象，這樣炎癥反應(yīng)比較典型。

TLR4表達(dá)會(huì)受到某些疾病的影響，比如結(jié)締組織病、近期的感染、心肌缺血、梗死、肝缺血等，因此入組條件排除了這些患者,入組的急性腦梗死患者絕大多數(shù)是動(dòng)脈粥樣硬化型，為避免動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)表達(dá)TLR4的影響,我們選擇無腦梗死的動(dòng)脈粥樣硬化患者為對(duì)照組。本研究檢測(cè)了腦梗死組、動(dòng)脈硬化組、健康組TLR4的表達(dá)變化、細(xì)胞因子TNF-α、IL-6濃度，以及它們之間的相關(guān)性。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)急性腦梗死組較其他兩組mRNA的表達(dá)、TNF-α、IL-6濃度明顯增高,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mRNA與血清TNF-α、IL-6濃度呈正相關(guān)，急性腦梗死時(shí)內(nèi)環(huán)境缺血缺氧，血管內(nèi)皮通透性增加，致使腦組織壞死物質(zhì)釋放,包括HSP70、高遷移率蛋白-1等，它們是TLR內(nèi)源性配體，吸引單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞趨化聚集,成為加劇炎性損傷的效應(yīng)細(xì)胞,這些細(xì)胞均有豐富的TLR 4表達(dá)。TLR 4mRNA表達(dá)上調(diào)促使炎性因子產(chǎn)生分泌增多，并在腦梗死的病理過程中參與炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6作為炎性損傷細(xì)胞因子中的典型代表，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎性反應(yīng)中起著重要作用,可以作為炎性程度的參考指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)腦梗死急性期血清TNF-α、IL-6因子濃度較動(dòng)脈硬化組及健康組明顯增高，并且發(fā)現(xiàn)mRNA與血清TNF-α、IL-6濃度呈正相關(guān)，提示TLR4在急性腦梗死中作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎性受體，誘發(fā)了細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與到急性腦梗死的發(fā)病機(jī)制中的炎癥反應(yīng)過程。

研究發(fā)現(xiàn)[7]，敲出小鼠TLR4后，TLR4缺陷小鼠的腦梗死面積、腦水腫面積及神經(jīng)功缺損評(píng)分均明顯低于對(duì)照組，說明TLR4在急性腦梗死中發(fā)揮著重要作用,TLR4缺陷降低了急性腦梗死損傷，也許是通過減少炎性因子的產(chǎn)生來減輕腦梗死的炎癥反應(yīng)?？赡苡蒚LR2和TLR4識(shí)別以啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。有學(xué)者認(rèn)為[8]發(fā)現(xiàn)在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后周圍區(qū)域的腦皮質(zhì)中,TLR4表達(dá)明顯升高,NF-κB、促炎癥細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子-1明顯上調(diào)。文獻(xiàn)報(bào)道[9,10]探討了髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,Myd88)在信號(hào)通路中所起的作用,Myd88是TLR通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。低溫制作的創(chuàng)傷動(dòng)物模型在腦組織損傷24 h后細(xì)胞炎性因子濃度明顯升高。而在對(duì)照組(Myd88缺失的小鼠)免疫反應(yīng)減弱,腦組織損害較輕。但具體的有關(guān)機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)在炎癥中的作用尚不完全明白。機(jī)制目前分析可能是啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)急激活的蛋白酶(JNK/SAPK)兩條途徑來激活炎性細(xì)胞,繼而IL-6、TNF-α等炎性因子的大量表達(dá),觸發(fā)一系列瀑布炎性反應(yīng)，具體上游、下游關(guān)鍵分子及具體機(jī)制仍有待繼續(xù)研究明確。

TLR作為啟動(dòng)機(jī)體天然免疫應(yīng)答的開關(guān),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要的作用。在急性腦梗死患者中，為阻止的TNF-α、IL-6等炎性因子的毒性效應(yīng)，我們可否使用合理的臨床手段暫時(shí)阻止TLR4的表達(dá)，其研究前景廣闊，有助于腦梗死發(fā)病機(jī)制的深入研究，也為目前臨床治療急性腦梗死提供新的補(bǔ)充。