操詹魁 劉穎 遲苗苗 姜晶晶 劉晶雪 溫紅玲 趙麗 遲連利 王志玉

250012濟(jì)南,山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院病毒學(xué)研究室(操詹魁、劉穎、遲苗苗、姜晶晶、劉晶雪、溫紅玲、趙麗、王志玉);250100濟(jì)南,山東大學(xué)國家糖工程技術(shù)研究中心微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(遲連利)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，屬于副粘病毒科禽腮腺炎病毒屬，是嚴(yán)重危害禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原體之一[1]。NDV包膜上鑲嵌著兩種膜蛋白，分別為融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)，兩種蛋白在膜融合及致病過程中均發(fā)揮重要作用[2]。

NDV HN蛋白具有促細(xì)胞融合活性、血吸附(hemadsorption，HAD)活性和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)活性，近年來還發(fā)現(xiàn)HN蛋白具有抗腫瘤效應(yīng)[3]。NDV HN蛋白與其他副粘病毒吸附蛋白結(jié)構(gòu)基本相似，但活性存在一定差異。根據(jù)副粘病毒吸附蛋白不同活性，可分為3類:(1)HN蛋白，具有HAD和NA活性，代表病毒為NDV和人副流感病毒(human parainfluenza virus，hPIV)；(2)H蛋白，具有HAD活性，無NA活性，代表病毒為麻疹病毒(measles virus，MeV)；(3)G蛋白，既無 HAD又無 NA活性，代表病毒為呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)[4]。關(guān)于膜融合的機(jī)制研究表明，HN蛋白首先結(jié)合宿主細(xì)胞膜表面的唾液酸受體，產(chǎn)生某種信號(hào)到頸部，HN和F蛋白由此產(chǎn)生相互作用，受到激活后，F(xiàn)蛋白發(fā)生一系列水解并重新折疊產(chǎn)生融合肽，介導(dǎo)細(xì)胞融合。NDV HN蛋白頸部91～112氨基酸(aa)序列與頭部殘基相互作用，對(duì)于頭部結(jié)構(gòu)的正常轉(zhuǎn)換和F蛋白的激活具有重要作用[5-7]。

為了探討不同副粘病毒吸附蛋白頭頸部相互作用區(qū)(91～112)對(duì)F蛋白激活和膜融合影響，本研究設(shè)計(jì)引物構(gòu)建NDV HN缺失突變體和嵌合體，通過檢測(cè)突變體蛋白功能及表達(dá)效率的變化，明確NDV HN蛋白頭頸部相互作用對(duì)于細(xì)胞融合的影響，為研發(fā)高效特異的抗病毒疫苗奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒株 痘苗病毒重組株vTF7-3和野毒株由Moss教授(美國國家過敏和傳染病研究所)惠贈(zèng)，滴度分別為109PFU/ml和107PFU/ml。BHK-21細(xì)胞(乳倉鼠腎細(xì)胞)由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)。

1.2 質(zhì)粒及菌株 載體為pBluescript SK(+)(pBSK+)質(zhì)粒；pBSK+-HN、pBSK+-F重組質(zhì)粒和PG1NT7β-gal質(zhì)粒均由Iorio教授(美國麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院)惠贈(zèng)；NDV AV株HN基因在載體上被引入Sac I(759nt)和Xba I(731nt)兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；NDV AV株F基因在載體上被引入Xho I(668nt)酶切位點(diǎn)；大腸埃希菌E.coil DH5α由本室保藏。

1.3 工具酶和試劑 限制性內(nèi)切酶和DEME高糖培養(yǎng)基、胎牛血清產(chǎn)自美國 Thermo Fisher公司；DNA Marker和Prime STAR聚合酶產(chǎn)自寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒產(chǎn)自美國Omega公司；Giemsa染色液產(chǎn)自Solarbio公司；神經(jīng)氨酸酶及β-半乳糖苷檢測(cè)試劑盒產(chǎn)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 突變體構(gòu)建 利用MEGA6軟件將hPIV3 HN、MeV H、RSV G蛋白與NDV HN蛋白片段進(jìn)行比對(duì)，定位與NDV HN 91～112 aa相應(yīng)位置的基因序列。根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以Sac I和Kpn I單酶切pBSK+-HN的產(chǎn)物為模板，分別PCR擴(kuò)增出兩條帶有同源末端的片段，再共轉(zhuǎn)化到DH5α中進(jìn)行同源重組，篩選陽性克隆，雙酶切鑒定成功后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 痘苗病毒-T7瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng) 將BHK-21細(xì)胞傳入12孔板，每孔加入1 ml vTF7-3株稀釋液(1:50)，提供突變體表達(dá)所需的T7 RNA聚合酶[8]。37℃孵育2 h，DMEM洗滌細(xì)胞1次，將配制完成的Exfect 2000體系轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以pBSK+空載為陰性對(duì)照，以pBSK+-HN為陽性對(duì)照。

表1 新城疫病毒HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)片段突變引物序列Tab.1 PCR primer sequences used in fragment mutagenesis of the interaction domain of the head and stalk of Newcastle disease virus HN protein

1.6 突變體蛋白功能測(cè)定 分別采用Giemsa染色和指示基因法測(cè)定各突變體HN蛋白促細(xì)胞融合活性，鴿紅細(xì)胞吸附法、酶催化熒光法測(cè)定各突變體的受體識(shí)別活性、神經(jīng)氨酸酶活性，具體見本室常規(guī)方法[9]。

1.7 突變體蛋白細(xì)胞表面表達(dá)強(qiáng)度測(cè)定 通過間接免疫熒光法(indirect immunofluorescene assay，IFA)和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)定性定量測(cè)定突變體蛋白表達(dá)；一抗為小鼠抗NDV HN蛋白單克隆抗體(1∶100稀釋)，二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶200稀釋)，具體見本室常規(guī)檢測(cè)方法[10]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)指標(biāo)源于3次及以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并以ˉx±s形式表示，采用t檢驗(yàn)比較突變體和野生型蛋白的功能差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDV HN缺失和嵌合突變體的構(gòu)建 分別以Kpn I和Sac I單酶切pBSK+-HN質(zhì)粒，電泳后顯示兩條長度為4 799 bp的線性片段，PCR擴(kuò)增后得到兩條帶有同源末端的片段，再共同轉(zhuǎn)化到DH5α菌，提陽性質(zhì)粒雙酶切和 DNA測(cè)序，結(jié)果顯示4個(gè)NDV HN突變體均構(gòu)建成功。

2.2 NDV HN突變蛋白促細(xì)胞融合活性分析Giemsa染色結(jié)果顯示，4種突變體的促細(xì)胞融合活性均顯著下降，其中嵌合體Ch(MeV)，Ch(RSV)形成的合胞體相比野生型直徑明顯變小，數(shù)量也大幅減少；Ch(hPIV3)可見中等大小的合胞體，但數(shù)量與Ch(MeV)和Ch(RSV)無明顯差異；缺失突變體De(HN)鏡下未觀察到合胞體產(chǎn)生(圖1)。

定量結(jié)果顯示，嵌合體Ch(hPIV3)的促細(xì)胞融合活性呈中等幅度下降，為野生型的57.84%(P＜0.05)；Ch(MeV)和Ch(RSV)促細(xì)胞融合活性分別降為野生型的24.76%和29.42%(P＜0.01)；De(HN)突變體的促細(xì)胞融合活性下降程度最大，僅為野生型的3.83%(P＜0.001)(圖2)。4種突變體促細(xì)胞融合活性的定量結(jié)果與Giemsa染色結(jié)果基本一致。

2.3 NDV HN突變蛋白HAD活性分析 突變體De(HN)的HAD活性下降幅度最大，至野生型的13.48%(P ＜0.01)；突變體 Ch(MeV)、Ch(RSV)的活性也明顯下降，分別為野生型的36.25%和34.93%(P＜0.05)；嵌合體Ch(hPIV3)的HAD活性較其他突變體高，為野生型的65.22%(P＜0.05)(圖2)。

圖1 新城疫病毒野生型和突變體HN蛋白與野生型F蛋白共表達(dá)后細(xì)胞融合情況Note:Giemsa staining(200×).Arrows indicate syncytiumFig.1 Cell fusion induced by co-expressing wt or mutant Newcastle disease virus HN proteins with wt Newcastle disease virus F protein

圖2 新城疫病毒野生型和突變體HN蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)效率及功能定量測(cè)定結(jié)果Note:Quantitative results came from three independent assays.Standard deviations are represented with error bars.Asterisk(?)show significant differences compared with wt HN(? P ＜0.05，?? P ＜0.01，??? P ＜0.001)Fig.2 The analysis of cell surface expression efficiency and functions of wt and mutant Newcastle disease virus HN proteins

2.4 NDV HN突變蛋白NA活性分析 各突變體的NA活性相比野生型均出現(xiàn)不同程度的下降，其中De(HN)的NA活性降為野生型的10.81%(P＜0.01)；突變體 Ch(hPIV3)、Ch(MeV)和 Ch(RSV)的NA活性出現(xiàn)中等幅度下降，分別為野生型的60.35%、54.42%和50.13%(P＜0.05)(圖2)。

2.5 NDV HN突變蛋白細(xì)胞表面表達(dá)強(qiáng)度分析熒光顯微鏡下觀察顯示，Ch(hPIV3)，Ch(MeV)，Ch(RSV)均有面積較大的黃綠色熒光，De(HN)僅有零星分布的熒光，在細(xì)胞表面幾乎無表達(dá)(圖3)。流式結(jié)果顯示，各嵌合體表達(dá)效率相比野生型均不同程度下降，分別為野生型HN基因細(xì)胞表面表達(dá)效率的75.65%、82.20%、70.16%(P ＞0.05)，缺失突變體De(HN)表面效率僅為野生型的9.04%(P＜0.001)(圖2)。

圖3 NDV HN野生型和突變體蛋白細(xì)胞表面表達(dá)的定性分析Note:Indirect immunofluorescent assay，IIFA(200×).Arrows indicate immunofluorescence Fig.3 Qualitative results of cell surface expression level of NDV wt HN and mutant HN proteins

3 討論

NDV HN蛋白和同源F蛋白共表達(dá)時(shí)可引起細(xì)胞融合，提示HN與F蛋白之間必定存在某種信號(hào)傳導(dǎo)或相互作用。Welch等[11]為此提出同源四聚體頭部上抬和下垂模型，即在HN蛋白結(jié)合受體前，下垂的HN頭部(4-heads down)掩蓋了HN 4HB中上段區(qū)域與F蛋白作用的氨基酸殘基，阻礙了F蛋白與4HB區(qū)域的相互作用；HN蛋白與受體結(jié)合后，上抬的HN頭部(4-heads up)暴露了HN與F蛋白相互作用區(qū)，使F蛋白激活。這里涉及到兩個(gè)四螺旋束狀(4HB)頸部相互作用區(qū)，一是HN頸部與F蛋白的相互作用區(qū)(49～78)，該區(qū)直接參與F蛋白的激活；另一個(gè)是HN頸部與頭部的相互作用區(qū)(91～112)，其在維持頭部模型的正常轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。目前，研究主要集中在HN頸部與F蛋白的相互作用區(qū)，對(duì)于HN頭頸部相互作用區(qū)的片段突變研究仍未見報(bào)道。

本研究4種突變體HN蛋白的促細(xì)胞融合活性均不同程度下降，提示NDV HN頭頸部相互作用區(qū)(91～112)對(duì)于HN蛋白的促細(xì)胞融合活性具有重要的影響。通過IFA和FCM定性定量測(cè)定了4種HN突變蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，突變體De(HN)在細(xì)胞表面表達(dá)效率僅為野生型的9.04%，接近于陰性對(duì)照結(jié)果，提示缺失突變體De(HN)促細(xì)胞融合活性的消失與其未能在細(xì)胞表面有效表達(dá)有關(guān)，這可能是91～112aa片段缺失引起蛋白異常折疊，使HN蛋白表達(dá)后不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面或者球狀頭部抗原活性位點(diǎn)失活；各嵌合體Ch(hPIV3)、Ch(MeV)、Ch(RSV)細(xì)胞表面表達(dá)效率位于70%～83%之間，與野生型相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明NDV HN 91～112aa片段置換不影響多肽正常折疊成HN蛋白頸部四聚體α螺旋結(jié)構(gòu)。

為了確定嵌合體蛋白的促細(xì)胞融合能力的降低是否與HN球狀頭部活性改變有關(guān)，通過血吸附試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶試驗(yàn)測(cè)定突變體的HAD和NA活性，結(jié)果顯示兩種活性均大幅下降，且嵌合突變體HAD活性與其促細(xì)胞融合活性變化有較強(qiáng)的一致性，與NA活性也呈現(xiàn)近似正向關(guān)系。此外，MEGA單獨(dú)比對(duì)結(jié)果顯示hPIV3與NDV的同源性較高，推測(cè)Ch(hPIV3)相比Ch(MeV)和Ch(RSV)促細(xì)胞融合活性較強(qiáng)是可能與某些影響HN蛋白功能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)未發(fā)生突變或者突變未影響到原位點(diǎn)的活性有關(guān)。本研究中，各嵌合體NA和HAD活性均出現(xiàn)較大幅度的下降，可能與關(guān)鍵氨基酸突變后HN頭部傳導(dǎo)信號(hào)發(fā)生衰減，導(dǎo)致HN和F的相互作用能力減弱，不能充分激活F蛋白有關(guān)。

研究表明，副粘病毒F蛋白受到激活水解、產(chǎn)生融合肽是膜融合的關(guān)鍵步驟，而其同源吸附蛋白的構(gòu)象改變是F蛋白激活的重要原因[12]。目前關(guān)于F蛋白激活的具體機(jī)制尚有一定的爭論，有研究顯示HN蛋白頭部NA和HAD活性與HN的促細(xì)胞融合功能相互獨(dú)立，無頭的副粘病毒吸附蛋白突變體也能激活F蛋白導(dǎo)致部分融合產(chǎn)生，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討[13]。無論如何，副粘病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制和增殖的過程中，HN頭部識(shí)別和結(jié)合唾液酸受體是NDV包膜與宿主細(xì)胞膜融合的首要步驟，受體結(jié)合后產(chǎn)生的某種信號(hào)對(duì)于F蛋白激活所引發(fā)的細(xì)胞融合也具有顯著的促進(jìn)作用[14]。

綜上所述，NDV HN頭頸部相互作用區(qū)(91～112)對(duì)維持和促進(jìn)HN的促細(xì)胞融合功能具有重要意義，本研究為定位頭頸部相互作用區(qū)關(guān)鍵氨基酸，進(jìn)一步研究NDV HN蛋白促細(xì)胞融合機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

利益沖突 無