范麗霞 王衛(wèi)軍 巴卓瑪 趙生倉 李崇亥 姜雙應 嚴冬梅 冀天嬌

810007西寧,青海省疾病預防控制中心衛(wèi)生檢驗檢測中心(范麗霞、王衛(wèi)軍、巴卓瑪、趙生倉、李崇亥、姜雙應);102206北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(嚴冬梅、冀天嬌)

手 足 口 病 (hand， foot and mouth disease，HFMD)是由腸道病毒(human enterovirus，HEV)引起的傳染病，其中以腸道病毒A組71型(human enterovirus group A type 71，EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16，CV-A16)感染最為多見。自1974年Schmidt等[1]首次報道以來，全世界很多國家和地區(qū)先后報道了EV-A71的感染和流行情況[2-3]。近10年的流行病學研究顯示，全球各地HFMD暴發(fā)流行主要是由EV-A71引起[4-9]。青海省從2008年開始，每年對EV-A71的流行情況進行監(jiān)測，實驗室數(shù)據(jù)顯示2012、2013、2015和2017年以EV-A71為優(yōu)勢病毒株，實驗室核酸檢測陽性標本中EV-A71所占的比例分別為93.71%、65.52%、40.81%和42.15%。本文對2016—2017年青海省HFMD的主要病原體EV-A71的基因特征進行分析，加強對EV-A71的分子流行病學監(jiān)測，了解EV-A71的基因特征，對預防和控制EV-A71的暴發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標本采集 收集2016—2017年青海省三家哨點醫(yī)院的患者咽拭子標本566份，和8個市(州)級網(wǎng)絡實驗室核酸檢測陽性標本585份。

1.2 核酸檢測 按照衛(wèi)生部發(fā)布的《HFMD標本采集及檢測技術方案》[10]，采用江蘇碩世病毒核酸提取試劑盒對咽拭子標本進行病毒RNA提取，提取步驟按說明書操作進行。采用江蘇碩世rRT-PCR分型試劑盒對所有標本進行EV-A71、CV-A16和其他HEV檢測。

1.3 病毒分離 對核酸檢測為陽性的標本采用人橫紋肌肉瘤細胞(human rhabdomyosarcoma，RD)細胞進行病毒分離，RD細胞由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所國家脊髓灰質(zhì)炎實驗室提供。每1份標本接種2支RD細胞，每支接種0.2 ml的標本懸液，置36℃培養(yǎng)7 d。每天觀察細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)并進行記錄。每份標本在RD細胞上至少傳兩代，出現(xiàn)腸道病毒特異的CPE后，保存在—20℃條件下待用。

1.4 EV-A71全長VP1編碼區(qū)擴增 用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，USA)提取病毒核酸。使用PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit Ver.2(TaKaRa，大連)試劑盒對分離的EV-A71毒株全長VP1編碼區(qū)進行擴增，擴增引物參照文獻[11]。

1.5 核苷酸序列測定 擴增后的陽性產(chǎn)物使用QIA-quickPCR purification kit(Qiagen，USA)試劑盒純化，然后分別使用上下游引物，按Big DyeTM Terminator V3.0 CycleSequencing Ready reaction(Applied Biosystems，USA)試劑盒中的標記反應條件進行雙向標記反應。標記產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠G-50(Pharmacia，Sweden)純化后，于 ABI 3500型序列測定分析儀上(Applied Biosystems，Japan)自動測序和分析。

1.6 生物信息學分析 使用序列的校對和整理軟件Sequencher 5.0進行序列圖譜整理，使用分子進化遺傳分析(Molecular Evolution Genetics Analysis，MEGA)6.0軟件(Sudhir Kumar，Arizona State University，Arizona，USA)中的ClustalW 軟件包進行多序列比對，并采用鄰接法(Neighborjoining，NJ)構建基于EV-A71毒株VP1編碼區(qū)的親緣關系樹。

2 結果

2.1 EV核酸檢測 2016—2017年青海省各網(wǎng)絡實驗室及監(jiān)測哨點醫(yī)院共采集HFMD病例標本1 446份，病毒核酸檢測陽性 984份，總陽性率為68.05%。

2.2 病毒分離與陽性分離物的RT-PCR鑒定984份標本在RD細胞上進行病毒分離，經(jīng)觀察出現(xiàn)典型腸道病毒CPE的有164株病毒，經(jīng)rRT-PCR腸道病毒定型，114株鑒定為EV-A71。

2.3 用于研究的病毒 114份EV-A71的分離物分別分離自114例HFMD病例。相關病例年齡≤13歲，男性60例，女性54例，性別比1.11∶1。2016年分離15株，2017年分離99株，分別來自青海省西寧市(68株)、海東市(44株)和海北州(2株)。

2.4 EV-A71分離株VP1編碼區(qū)核苷酸序列親緣進化樹分析 114株青海省EV-A71分離株的VP1區(qū)核苷酸序列的長度都是891個核苷酸，編碼297個氨基酸。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載54個各基因型及基因亞型(A～G，C1～C5)VP1區(qū)核苷酸參考序列，分別包含來自歐洲、亞洲、美洲和澳洲1970—2013年的代表株，其中C4代表株主要來自于中國，與114株青海省EV-A71分離株進行核苷酸序列同源性分析。2016—2017年，EV-A71毒株VP1編碼區(qū)核苷酸序列與C4基因亞型代表株具有最高同源性，為89.8% ～96.7%。C4基因亞型又分為C4a和C4b分支，本研究毒株與C4a(我國本土代表序列)和C4b分支核苷酸序列同源性分別為94.4%～96.7%和89.8%～92.7%。本研究毒株相互間的核苷酸序列同源性為91.5% ～100%，氨基酸序列同源性為9 8.3% ～1 0 0%。其中，2 0 1 6年毒株間核苷酸和氨基酸序列平均差異分別為2.3%和0.4%；2 0 1 7年毒株間核苷酸和氨基酸序列平均差異分別為3.4%和0.8%；2 0 1 6與2 0 1 7年毒株，核苷酸和氨基酸序列平均差異為3.6%和0.7%。

圖1 基于VP1編碼區(qū)(891bp)構建青海2016—2017年分離株與其它EV-A71代表毒株的親緣性進化樹Note:green dots represent EV-A71 strains of 2016，red dots represent EV-A71 strains of 2017Fig.1 Phylogenetic tree of EV-A71 isolates was constructed based on the VP1 coding region(891bp)in Qinghai province from 2016 to 2017)

2016—2017年青海省流行的EV-A71可以被劃分為2個進化分支，即lineage1和lineage2，分別包含100株和14株EV-A71。lineage1與lineage2兩組間的核苷酸與氨基酸差異分別為6.95%和1.19%。其中 lineage1包含絕大多數(shù)(13/101，87.12%)的2017的 EV-A71毒株和幾乎全部的2016年EV-A71毒株，分布于西寧市和海東市，是本省流行優(yōu)勢分支。而lineage2僅有1株分離自2016年的EV-A71毒株，其余均為2017年毒株?？梢娗嗪Ｊ〉腅V-A71傳播鏈并不唯一，且在2017年進化為較為明顯的2個傳播鏈(圖1)。

3 討論

HFMD是由多種腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。由于腸道病毒傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快等特點，HFMD常出現(xiàn)暴發(fā)或流行。開展HFMD流行特征及病原學監(jiān)測對于防控策略的制定具有重要意義。而HFMD分子流行病學監(jiān)測是其中的重要組成部分，也是HFMD監(jiān)測系統(tǒng)在實驗室網(wǎng)絡方面最重要的任務之一。

青海省2016—2017年分離到的114株EV-A71大部分來自人口相對密集的西寧市和海東市，經(jīng)核苷酸同源性和基因親緣性關系分析，證實全部屬于C4基因型中的C4a基因亞型，和全國的流行情況一致[5]。青海省2016—2017年114株EV-A71分屬2個不同分支，說明引起青海HFMD流行的EV-A71傳播鏈并不唯一。同時，基于基因親緣性關系樹發(fā)現(xiàn)，青海省不同傳播鏈上的EV-A71，分別與近年來在中國其他省流行的C4a基因亞型EV-A71在基因親緣關系和流行時間關系上都很接近，說明青海省EV-A71不是獨立進化的，而是與中國其他省流行的EV-A71在共同進化。

盡管HFMD的實驗室監(jiān)測在青海省已經(jīng)開展，建立了青海省HFMD的EV-A71毒株庫和基因資源庫，積累了一定的EV-A71分子流行病學研究數(shù)據(jù)，但是青海省EV-A71監(jiān)測系統(tǒng)還比較薄弱，偏遠的玉樹州、果洛州報告病例少，未開展采樣和實驗室檢測工作，因而得到的數(shù)據(jù)還不全面，應進一步加強并擴大監(jiān)測范圍，建立青海省完整的EV-A71分子流行病學基線數(shù)據(jù)，以全面了解并闡明青海省流行EV-A71的基因型和基因亞型的特征，更好的為青海省HFMD的監(jiān)測與防控提供實驗室參考。

利益沖突 無