王聯(lián)君 李艷宇

100050北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心

1980年，手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)第1次在我國被報道。HFMD是一種由腸道病毒引起的急性傳染病，病毒型別眾多，優(yōu)勢毒株不斷發(fā)生更替和改變[1]，以往的研究[2-4]顯示HFMD的主要病原體為腸道病毒A組71(EVA71)和柯薩奇病毒A組16型(CV-A16)。但近年一些地區(qū)研究[5-6]顯示，引起HFMD的病原以非EVA71非CV-A16的其他腸道病毒為主，EV-A71和CV-A16占一定比例。自HFMD于2008年5月份被衛(wèi)生部列入丙類傳染病后，北京市東城區(qū)每年都進(jìn)行HFMD監(jiān)測。本研究通過對北京市東城區(qū)2017年分離到的EV-A71和CV-A16毒株VP1序列進(jìn)行測序和進(jìn)化分析，為本轄區(qū)的HFMD預(yù)防提供分子生物學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 來自本轄區(qū)哨點(diǎn)監(jiān)測醫(yī)院在2017年1月1日至12月31日期間采集的HFMD疑似病例的咽拭子樣本，通過Real-time PCR測定為腸道病毒通用引物陽性、EV-A71陽性或者CV-A16陽性(江蘇碩世生物科技有限公司)。

1.2 病毒分離培養(yǎng) 將EV-A71及CV-A16核酸陽性的咽拭子按照《手足口病實(shí)驗(yàn)室手冊》(2010版)[7]接種在人橫紋肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma，RD)細(xì)胞上，每份樣本盲傳2代，每代培養(yǎng)7 d，將產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)的樣本凍存在-80℃，備用。

1.3 EV-A71和CV-A16 VP1區(qū)的擴(kuò)增及序列測定 將分離到的4株EV-A71和3株CV-A16用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取RNA；VP1引物序列參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計，用TaKaRa One step RTPCR試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，送上海伯杰生物有限公司進(jìn)行測序。

1.4 同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析 用DNAstar 5.0軟件分別對EV-A71和CV-A16 VP1序列的核苷酸和氨基酸的同源性進(jìn)行比較；用MEGA6.0進(jìn)行EVA71和CV-A16的VP1序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 HFMD病原監(jiān)測及毒株分離情況 北京市東城區(qū)在2017年1月1日-12月31日期間共檢測HFMD疑似病例咽拭子樣本95份，腸道病毒通用引物核酸陽性46份(占48.42%)，其中EV-A71陽性4份(占4.21%)，CV-A16陽性4份(占4.21%)，非EV-A71非CV-A16其他腸道病毒陽性38份(占40.00%)。EV-A71分離出陽性毒株4株，CV-A16分離出陽性毒株3株；非EV-A71非CV-A16其他腸道病毒陽性樣本上送北京市疾病預(yù)防控制中心。

2.2 EV-A71和CV-A16 VP1核苷酸和氨基酸同源性分析 4株EV-A71分離株的VP1基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比較高，分別為92.89% ～99.15%和97.32% ～98.66%；而與來自 GenBank中下載的參考毒株的序列比對，這4株EV-A71與C4a基因亞型中的VP1序列核苷酸同源性最高，達(dá)到91.87% ～96.60%，其次是C4b亞型。氨基酸同源性在不同型別之間差別不大，同源性高。3株CV-A16分離株的VP1序列核苷酸和氨基酸的同源性也比較高，分別為93.90% ～98.76%和98.32%～100.00%；而與來自GenBank中下載的參考毒株的序列比對看出，這3株CV-A16與B1b基因亞型中的VP1序列核苷酸同源性最高，達(dá)到90.91～97.62%，與A基因亞型差異較大。這些CV-A16毒株的氨基酸同源性最高達(dá)100%(見表1)。

表1 EV-A71(CV-A16)分離株與EV-A71(CV-A16)參考毒株VP1基因型或亞型的核苷酸和氨基酸同源性比較Tab.1 Comparison of nucleotide and amino acid homology of the VP1 genotype or subtype between EV-A71(CV-A16)isolated strains and EV-A71(CV-A16)reference strains

2.3 EV-A71和CV-A16 VP1種系進(jìn)化樹分析從圖1可以看出，分離的4株EV-A71病毒與基因庫中整理下載的參考株構(gòu)建的種系進(jìn)化樹上有A、B、C、D、E等幾大簇，2017年東城區(qū)分離的EV-A71都處于C4a分支，其中3株處在同一小分支上，與2010年鄭州分離株(KC493671)距離較近；另株與這3株距離較遠(yuǎn)，和2014年深圳分離株(KT428644)距離較近，形成一小分支。

從圖2可以看出，分離的3株CV-A16病毒株與基因庫中整理下載的參考株構(gòu)建的種系進(jìn)化樹上有A、B兩大簇，B又分為 B1和B2兩支，B1分為B1a、B1b、B1c三支；3株 CV-A16都屬于 B1b分支上，與2014年深圳分離株(KM215267)和2013年北京分離株(KP289415)親緣關(guān)系近，形成一小分支。

圖1 2017年北京東城區(qū)EV-A71分離株與參考株VP1序列親緣關(guān)系進(jìn)化樹Note:●indicates the VP1 coding region of EV-A71 strains in the studyFig.1 Phylogenetic tree based on the VP1 coding region of EV-A71 and its reference strains in Dongcheng district of Beijing in 2017

3 討論

HFMD是一種常見傳染病，多發(fā)生在低齡兒童中間。自20世紀(jì)60年代以來，其暴發(fā)和流行越來越頻繁，隨著時間推移和環(huán)境的改變，引起HFMD的病原譜不斷發(fā)生改變，從北京市東城區(qū)2017年HFMD監(jiān)測結(jié)果看出:該監(jiān)測年度HFMD以非EVA71非CV-A16其他腸道病毒為主，占總檢測樣本的40.00%，EV-A71和CV-A16也占一定比例都為4.21%，陽性率比較低，這與李姍姍[9]等對東城區(qū)2013—2015年HFMD實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)結(jié)果分析有所不同，引起這一改變的原因是由于病毒自身變異還是環(huán)境的影響有待進(jìn)一步研究，在今后的監(jiān)測中應(yīng)進(jìn)一步開展其他腸道病毒的基因分型，完善HFMD病原譜。

不同型別的腸道病毒引起的HFMD臨床癥狀相似，但EV-A71可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損害，甚至死亡[10]，CV-A16臨床癥狀較輕，但也可以引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，如孕婦自然性流產(chǎn)、肺部感染、無菌性腦膜炎等[11]。EV-A71和CV-A16都屬于腸道病毒小RNA病毒科，由單股正鏈RNA組成，其編碼的蛋白經(jīng)水解酶最終水解形成的蛋白中，VP1蛋白不僅決定病毒的抗原性，也是作為腸道病毒屬內(nèi)血清分型的依據(jù)。本研究對分離陽性的4株EV-A71和3株CV-A16進(jìn)行VP1基因序列測定分析，結(jié)果表明:4株EV-A71 VP1編碼區(qū)核苷酸序列與從GenBank中下載的其他型別(A型U22521、B型AB059813)參考毒株核苷酸差異在15.14% ～18.78%之間，同源性較差，通過核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)主要是某些核苷酸位點(diǎn)發(fā)生改變，但沒有出現(xiàn)大片段的缺失或增加。與C4a亞型代表株(2010年鄭州株KC493671)序列比對中核苷酸同源性為91.87% ～96.60%，氨基酸同源性為96.31% ～98.66%，核苷酸和氨基酸同源性較高，但由于這次分析毒株數(shù)有限，EV-A71 VP1序列中核苷酸、氨基酸序列的變化是否對HFMD臨床癥狀及其型別改變有影響需要進(jìn)行長期監(jiān)測分析研究。從EV-A71 VP1進(jìn)化樹上看出，4株EV-A71都位于位于C基因簇中的C4a亞型中，這說明2017年北京市東城區(qū)EV-A71毒株比較穩(wěn)定，基因型集中，與趙曦[12]、于秋麗[13]、陳瑞珊[14]等研究一致。4株EV-A71分離株中3株聚集成一簇，與鄭州株(KC493671)進(jìn)化距離很近，而與另1株(BJDC-EVA71-2)距離較遠(yuǎn)，這提示東城區(qū)2017年EV-A71可能存在不同的病毒來源，能否引起不同的傳播鏈需要進(jìn)一步動態(tài)監(jiān)測。有文獻(xiàn)[15-16]將CV-A16分為A、B兩個基因型，B型又分為B1和B2兩個基因亞型，B1基因亞型可被進(jìn)一步分為B1a、B1b和B1c亞型，本次研究的3株CV-A16 VP1編碼區(qū)核苷酸序列與從GenBank中下載的其他型別(A型U05876、B2型AB465370)序列相比較，其中核苷酸位點(diǎn)發(fā)生多處改變，導(dǎo)致其核苷酸同源性較差，但也沒有發(fā)生大片段的缺失和增加。這3株CV-A16與2014年深圳代表株(KM215267)核苷酸和氨基酸同源性很高，都屬于 B1b型，與國內(nèi)其他監(jiān)測一致[8，17-18]。

圖2 2017年北京東城區(qū)CV-A16分離株與參考株VP1序列種系進(jìn)化樹Note:●indicates the VP1 coding region of CV-A16 strains in the studyFig.2 Phylogenetic tree based on the VP1 coding region of CV-A16 and its reference strains in Dongcheng district of Beijing in 2017

由于本次研究只選取北京東城區(qū)2017監(jiān)測年度年中分離的 EV-A71和CV-A16毒株進(jìn)行分析，結(jié)果受到時間、地域和毒株數(shù)量的限制，繪制的親緣進(jìn)化分析結(jié)果會有一定偏倚。因此，要想準(zhǔn)確掌握本轄區(qū)HFMD病原譜構(gòu)成及病毒的變異進(jìn)化特征，就需要長期監(jiān)測獲得更多的數(shù)據(jù)，從而為HFMD的預(yù)防控制提供基礎(chǔ)資料。

利益沖突 無