陳國(guó)清 李春香 王瑤 李峰 徐士林 李長(zhǎng)城 邵榮標(biāo)

224001鹽城市疾病預(yù)防控制中心(陳國(guó)清、王瑤、李峰、徐士林、李長(zhǎng)城、邵榮標(biāo));

224002鹽城市婦幼保健院(李春香)

甲型流感病毒對(duì)人類(lèi)威脅最大，其表面兩個(gè)包膜糖蛋白抗原血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)有多種亞型的組合，能形成致病力、傳播力不一的新型病毒。2009年春，來(lái)源于北美的新的三源重配病毒甲型H1N1引起了21世紀(jì)首次流感大流行，國(guó)內(nèi)自四川首次發(fā)現(xiàn)病例后，也引起了全國(guó)范圍內(nèi)的流行[1-2]。據(jù)國(guó)家流感中心2009—2015年的流感監(jiān)測(cè)顯示，乙型、甲型H1N1和季節(jié)性H3N2三種亞型流感病毒交替或者同時(shí)流行，其中，甲型H1N1的流行已呈一定的季節(jié)性[3]。流感病毒HA和NA基因核苷酸位點(diǎn)的變異是其重要的分子變異基礎(chǔ)，兩者經(jīng)常處于抗原漂移變化的積累當(dāng)中，兩者編碼的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變異對(duì)病毒的抗原位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)以及耐藥位點(diǎn)等起決定性作用[4-6]。鹽城地區(qū)2009—2013年與江蘇省甲型H1N1流感監(jiān)測(cè)結(jié)果的流行趨勢(shì)一致[7]，為了解2014—2017年鹽城地區(qū)甲型H1N1流行特征、變異程度以及與推薦疫苗株的匹配程度，對(duì)甲型H1N1流感病毒HA和NA基因進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，從分子水平上揭示流感病毒的基因變異與流行的關(guān)系，為鹽城地區(qū)防控甲型H1N1的流行、病毒演化趨勢(shì)分析以及疫苗株的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 根據(jù)《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)方案》2010、2017版要求，按照流感樣病例定義，從鹽城市第一人民醫(yī)院、鹽城市第三人民醫(yī)院國(guó)家級(jí)哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院采集2014—2017年流感樣病例以及各地流感暴發(fā)疫情流感樣病例的鼻咽拭子，在4℃冷藏條件下于24 h內(nèi)送至鹽城市疾病預(yù)防控制中心流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)以及病毒分離。

1.2 方法

1.2.1 流感樣病例標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測(cè):用MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit提取試劑在自動(dòng)核酸提取儀上提取病毒RNA，采用甲乙型流感、禽流感H7N9病毒雙通道以及甲型H1N1、H3亞型(江蘇碩世生物)單通道流感病毒核酸熒光PCR試劑進(jìn)行流感樣病例標(biāo)本核酸檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作流程以及最終的結(jié)果判斷參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.2.2 病毒分離培養(yǎng)與鑒定:將甲型H1N1病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本采用狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)進(jìn)行病毒分離，出現(xiàn)細(xì)胞病變的樣本及時(shí)收獲，收獲之前凍融細(xì)胞1～2次，于-70℃凍存。采用國(guó)家流感中心下發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行微量血凝實(shí)驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)，對(duì)培養(yǎng)物的滴度以及從血清學(xué)的角度對(duì)甲型H1N1病毒進(jìn)行確認(rèn)，方法參照《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)方案》2010、2017 版。

1.2.3 甲型H1N1流感毒株HA1和NA基因擴(kuò)增:提取分離的甲型 H1N1流感毒株的 RNA，采用TaKaRa(貨號(hào):RR057A)One Step RT-PCR Kit進(jìn)行HA1和NA基因的擴(kuò)增。通過(guò)Premier5.0軟件在保守區(qū)設(shè)計(jì)HA1、NA基因引物。HA1基因上游引物:5′-ATGAAGGCAATACTAGTAG-3′； 下 游 引 物:5′-CGGCAATGGCCCCRAATAG-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 054 bp。 NA 基 因 上 游 引 物:5′-CAAAAGCAG GAGTTTAA AATG-3′；下游引物:5′-GAACAAATTAC TTGTCAATGG-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 435 bp。反應(yīng)體系配置以及擴(kuò)增條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。

1.2.4 甲型H1N1流感病毒HA1和NA基因PCR產(chǎn)物序列測(cè)定與分析:HA1和NA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司雙向測(cè)序，拼接的序列經(jīng)NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)確認(rèn)為甲型H1N1流感病毒 HA1、NA基因序列。自 GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中選取近年國(guó)內(nèi)部分省市甲型H1N1(包括國(guó)內(nèi)首發(fā)株 A/Sichuan/1/2009)代表株和2014—2017年北半球疫苗株A/California/07/2009(H1N1)、2017—2018年北半球疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)作為參比序列，截取HA1區(qū)序列以及全長(zhǎng)編碼區(qū)NA基因序列進(jìn)行分析，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件DNAStar中MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性分析，核苷酸序列比對(duì)采用mafft方法，以PhyML3.0軟件最大似然法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

圖1 2014—2017年鹽城地區(qū)流感病毒核酸陽(yáng)性率趨勢(shì)圖Fig.1 Tendency chart of the positive rates of the nucleic acid of influenza viruses in 2014-2017

圖2 2014—2017年鹽城地區(qū)不同亞型流感病毒分布情況Fig.2 Distribution of different subtypes of influenza viruses in 2014-2017

2 結(jié)果

2.1 2014—2017年鹽城地區(qū)流感病毒核酸檢測(cè)及流行情況 2014—2017年，鹽城地區(qū)共檢測(cè)流感樣病例4 942例，核酸檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)397例，陽(yáng)性率8.03%(397/4 942)。甲型H1N1核酸陽(yáng)性數(shù)103例，陽(yáng)性率2.08%(103/4 942)，占比25.94%(103/397)。其中2014—2017年甲型H1N1核酸陽(yáng)性數(shù)分別為46例、4例、44例、9例，當(dāng)年陽(yáng)性占比分別為 45.10%(46/102)、4.49%(4/89)、55%(44/80)、7.14%(9/126)。 2014—2017年甲型 H1N1流感病毒每年都有檢出，已成為重要的季節(jié)性流感病毒，其中，2014、2016年為當(dāng)年流行的優(yōu)勢(shì)毒株，其他亞型的流感病毒成散在性分布。2014—2017年冬春季為流感病毒傳統(tǒng)流行的高峰期，除2015、2017年外夏季流感峰不明顯。見(jiàn)圖1、2。

2.2 甲型H1N1流感病毒HA1和NA基因核苷酸和氨基酸序列同源性比較 按流行月選取的2014—2017年鹽城地區(qū)分離的甲型 H1N1病毒(2014年6株、2015年未分離到毒株、2016年7株、2017年4株)HA1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為97.2% ～100%，96.6% ～100%；NA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為98.3%～100%，97.8% ～100%。2014、2016和2017年鹽城地區(qū)甲型H1N1病毒HA1基因核苷酸同源性分別為99.7% ～99.9%，99.2% ～99.9%，97.3% ～100%；HA1基因氨基酸同源性分別為99.4% ～100%，98.5% ～100%，96.9% ～100%。2014、2016和2017年鹽城地區(qū)甲型H1N1病毒NA基因核苷酸同源性分別為 99.6% ～99.9%，99.6% ～100%，98.5%～100%；NA基因氨基酸同源性分別為99.3% ～100%，99.3% ～100%，98.4% ～100%。2014—2017年分離的 17株甲型 H1N1病毒與2014—2017年北半球疫苗株A/California/07/2009(H1N1)HA1基因核苷酸、氨基酸序列同源性分別為96.9% ～98.3%，95.7% ～97.6%；NA基因核苷酸、氨基酸序列同源性分別為97.7% ～98.9%，96.4% ～98.0%。與2017—2018年北半球疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)HA1基因核苷酸、氨基酸序列同源性分別為97.3% ～99.3%，97.2% ～99.1%；NA基因核苷酸、氨基酸序列同源性分別為98.5% ～99.6%，98.4% ～99.6%。

圖3 鹽城地區(qū)2014—2017年甲型H1N1流感病毒HA1基因(A)、NA基因(B)遺傳進(jìn)化樹(shù)▼vaccine strain A/California/07/2009(H1N1pdm)；■vaccine strain A/Michigan/45/2015(H1N1pdm)；O strains isolated in Jiangsu province；▲strains isolated in Yancheng area in 2014；◆strains isolated in Yancheng area in 2016；●strains isolated in Yancheng area in 2017Fig.3 Phylogenetic trees of the HA1 and HA genes sequences of influenza A/H1N1(09pdm)viruses in Yancheng area in 2014-2017

2.3 甲型H1N1流感病毒HA1和NA基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 鹽城地區(qū)2014—2017年分離的17株毒株HA1和NA基因在進(jìn)化樹(shù)的位置基本對(duì)應(yīng)，按分離年代的對(duì)應(yīng)關(guān)系種系發(fā)生樹(shù)分為4個(gè)進(jìn)化分支，分支1由2009—2013年的毒株構(gòu)成，分支2由2014年的毒株構(gòu)成，分支3主要由2016年毒株構(gòu)成，2017年的毒株單獨(dú)聚集成簇。鹽城地區(qū)甲型H1N1毒株同一年份的毒株親緣關(guān)系相近，基本聚集成簇位于同一進(jìn)化分支，除A/Jiangsu-YC/SWL1554/2017和A/Jiangsu-YC/SWL1707/2017分布于分支3，隨著時(shí)間的推移，與2014—2017年北半球疫苗株A/California/07/2009(H1N1)遺傳距離越來(lái)遠(yuǎn)，分化成幾個(gè)分支，其中，2017年代表株A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017和A/Jiangsu-YC/SWL 1545/2017與其他省份代表株聚集成簇，與2017—2018年北半球疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)親緣關(guān)系相近，在同一進(jìn)化分支中。見(jiàn)圖3。

2.4 甲型H1N1流感病毒HA1基因分子特征 鹽城地區(qū)2014—2017年分離的17株甲型H1N1病毒與兩疫苗株相比，HA1區(qū)未發(fā)生核苷酸的丟失和插入，長(zhǎng)度 981 bp。與疫苗株 A/California/07/2009(H1N1)相比，17株分離株HA1區(qū)涉及23個(gè)氨基酸的位點(diǎn)的變異，變異率 7.03%(23/327)，在P83S、D97N、K163Q、S185T、S203T、A256T、K283E、I321V共8個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了變異；與疫苗株 A/Michigan/45/2015(H1N1)相比，HA1區(qū)涉及15個(gè)氨基酸的位點(diǎn)的變異，變異率4.59%(15/327)。其中，2016年7株分離株、2017年2株分離株(A/Jiangsu-YC/SWL1554/2017和A/Jiangsu-YC/SWL 1707/2017)與疫苗株相比在3個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了V152T、V173I、A261S的變異，其他變異位點(diǎn)成散在性分布。

表1 2014—2017年鹽城地區(qū)分離的甲型H1N1流感病毒HA1區(qū)氨基酸變異位點(diǎn)分析Tab.1 Analysis of variation sites in the amino acid sequences of HA1 genes of influenza A/H1N1(09pdm)viruses isolated in Yancheng area in 2014-2017

甲型H1N1流感病毒HA1基因編碼的蛋白抗原決定簇涉及44個(gè)氨基酸，分布在Ca、Cb、Sa和Sb抗原表位[8-9]。與疫苗株 A/California/07/2009(H1N1)相比，17株分離株共涉及3個(gè)抗原表位和6個(gè)抗原位點(diǎn)(Ca 1個(gè)、Sa 3個(gè)、Sb 2個(gè))，變異位點(diǎn)為K154R、S162Ng、K163Q、S185T、L191I、S203T。 與A/Michigan/45/2015(H1N1)相比，其共涉及2個(gè)抗原表位和3個(gè)抗原位點(diǎn)(Sa 2個(gè)、Sb 1個(gè))，變異位點(diǎn)為K154R、N162S、L191I。甲型H1N1病毒受體結(jié)合位點(diǎn)由220環(huán)(218～225位)、130環(huán)(132～135位)、190螺旋(187～195位)構(gòu)成[10]。與疫苗株相比，17株分離株中220環(huán)中有3個(gè)位點(diǎn)(D222G/N、G223R和E224K)發(fā)生變異，190螺旋中涉及1個(gè)位點(diǎn)(L191I)的變異。

利用Net NGlyc1.0在線(xiàn)糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，鹽城地區(qū)2014—2017年分離的17株甲型H1N1病毒HA1基因編碼的蛋白具有6個(gè)固定糖基化位點(diǎn)(10NNST、 11NST、 23NVT、 87NGT、 276NTT、287NTS)。其中，2017年兩株毒株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017、A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)與疫苗株 A/Michigan/45/2015(H1N1)均增加了1個(gè)162NQS糖基化位點(diǎn)。見(jiàn)表1。

2.5 甲型H1N1流感病毒NA基因分子特征 鹽城地區(qū)2014—2017年分離的17株甲型H1N1流感病毒與疫苗株相比，NA基因編碼區(qū)片段未發(fā)生核苷酸的丟失和插入，長(zhǎng)度1 410 bp。NA基因編碼蛋白包括8個(gè)酶活性催化位點(diǎn)(R118、D151、R152、R225、E277、R293、R368、Y402)、11 個(gè)輔助氨基酸位點(diǎn)(E119、R156、W179、S180、D/N199、I223、E228、H275、E278、N295、E425)以及 5 個(gè)耐藥位點(diǎn)(E119、R152、H275、N295 和 S247)[11-13]，鹽城地區(qū) 17 株分離株中均未發(fā)生上述氨基酸位點(diǎn)的變異。

疫苗株A/California/07/2009(H1N1)NA基因編碼蛋白有8個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，分布在50、58、63、68、88、146、235 和386 位點(diǎn)中。 鹽城地區(qū)2 株分離株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017和A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)增加了1個(gè)糖基化位點(diǎn)42NRS，其他15株分離株與疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)均增加了42NQS位點(diǎn)，所有分離株均減少了386NFS糖基化位點(diǎn)，其中 A/Jiangsu-YC/SWL1440/2016丟失了146NGT糖基化位點(diǎn)。

3 討論

鹽城地區(qū)2014—2017年甲型H1N1流感病毒每年都有檢出，其中，2014、2016年成為當(dāng)年流行的優(yōu)勢(shì)毒株，與季節(jié)性流感H3N2、乙型流感共同流行。2014—2017年冬春季為流感病毒傳統(tǒng)流行的高峰期，優(yōu)勢(shì)毒株流行的強(qiáng)度決定了流感病毒流行的高峰期。鹽城地區(qū)分離的17株甲型H1N1流感病毒HA1、NA基因序列與疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)的同源性要高于疫苗株A/California/07/2009(H1N1)，同年內(nèi)甲型 H1N1毒株 HA1、NA基因的序列同源性相對(duì)較高，說(shuō)明流行的甲型H1N1毒株在逐年進(jìn)化變異。

與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比，疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)和鹽城地區(qū)17株分離株HA1基因早期3個(gè)適應(yīng)性突變位點(diǎn)P83S、S203T、I321V 依然存在[14]，隨著病毒的選擇進(jìn)化又增加了5個(gè)變異位點(diǎn)(D97N、K163Q、S185T、A256T、K283E)。17株分離株抗原決定簇位點(diǎn)涉及6個(gè)氨基酸位點(diǎn)分布在3個(gè)抗原表位(Ca 1個(gè)、Sa 3個(gè)、Sb 2個(gè))，不斷的處于抗原漂移的選擇壓力中。與疫苗株相比，2016年7株分離株與2017年兩株分離株(A/Jiangsu-YC/SWL1554/2017和A/Jiangsu-YC/SWL1707/2017)3個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了 V152T、V173I、A261S變異，其生物學(xué)意義值得關(guān)注。鹽城地區(qū)分離的17株毒株中關(guān)于組織侵嗜性變化的受體結(jié)合位點(diǎn)共涉及220環(huán)、190螺旋兩個(gè)區(qū)域，其中A/Jiangsu-YC/SWL1453/2014、 A/Jiangsu-YC/SWL1381/2016和A/Jiangsu-YC/SWL1554/2017涉及D222G/N變異，能夠在臨床引起重癥[15-16]，其他受體結(jié)合位點(diǎn)的變異導(dǎo)致的臨床意義需待進(jìn)一步研究。17株分離株NA基因編碼序列涉及的酶活性位點(diǎn)、輔助酶活性位點(diǎn)以及耐藥位點(diǎn)均未發(fā)生變異，說(shuō)明NA基因編碼的關(guān)鍵氨基酸序列位點(diǎn)很保守。鹽城地區(qū)2014—2017年分離的17株毒株HA1和NA基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)的位置基本一致，分為4個(gè)進(jìn)化分支，同一年份的毒株親緣關(guān)系相近，基本聚集成簇位于同一進(jìn)化分支，進(jìn)化上相對(duì)一致又保守，與江蘇省2009—2017年代表株聚類(lèi)關(guān)系基本一致，說(shuō)明江蘇省內(nèi)流行的毒株差異不大，同進(jìn)化同循環(huán)，可能有著共同的起源。2014—2017年鹽城代表株與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)遺傳距離越來(lái)越遠(yuǎn)，說(shuō)明2014—2017年鹽城地區(qū)分離的毒株與A/California/07/2009(H1N1)疫苗株不匹配程度越來(lái)越高，差異隨時(shí)間的變化加大，增加了人群免疫空白的積累，2017年分離的毒株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017、A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)與疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)聚類(lèi)成簇，匹配度較好，能對(duì)人體產(chǎn)生有效保護(hù)抗體。

流感病毒HA基因和NA基因編碼蛋白糖基化位點(diǎn)的增加、減少以及非糖基化都可能會(huì)影響到蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而影響到病毒的抗原性、致病力等其他生物學(xué)功能性。與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比，2017年分離的2株毒株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017、A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)和疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)HA1基因編碼序列增加了1個(gè)162NQS糖基化位點(diǎn)。NA基因編碼序列中，鹽城地區(qū)2株分離株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017和A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)增加了1個(gè)糖基化位點(diǎn)42NRS，其他15株分離株和疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)增加了42NQS位點(diǎn)，所有分離株均減少了386NFS糖基化位點(diǎn)，其中 A/Jiangsu-YC/SWL 1440/2016丟失了146NGT糖基化位點(diǎn)。新積累的糖基化位點(diǎn)可能會(huì)掩蓋之前的抗原位點(diǎn)，能夠逃避人體的免疫壓力。

綜上所述，2014—2017年鹽城地區(qū)流行的甲型H1N1毒株的HA1基因編碼的氨基酸位點(diǎn)正逐漸發(fā)生變異，氨基酸變異位點(diǎn)的積累可能會(huì)引起流感病毒抗原決定簇位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)的遺傳多樣性增加?；蚍治鲲@示2014—2017年鹽城地區(qū)分離的毒株與A/California/07/2009(H1N1)疫苗株匹配效果不理想，2017年分離的毒株與疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)匹配度較好。本研究未發(fā)現(xiàn)與NA基因編碼氨基酸有關(guān)酶活性位點(diǎn)以及耐藥位點(diǎn)的變化。接下來(lái)必須加強(qiáng)對(duì)鹽城地區(qū)甲型H1N1流感病毒動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)有流行病學(xué)意義的變異株，為流感防控以及疫苗研制工作打下基礎(chǔ)。

利益沖突 無(wú)