蘇秋東 郭敏卓 邱豐 賈志遠(yuǎn) 范雪亭 孟慶玲 田瑞光 畢勝利 伊瑤 楊俊梅

102206北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(蘇秋東、邱豐、賈志遠(yuǎn)、范雪亭、孟慶玲、田瑞光、畢勝利、伊瑤);100026北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心(郭敏卓);450053,鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(楊俊梅)

EB病毒(epstein-Barr virus，EBV)廣泛存在于自然界，是一種世界性感染病原體，影響超過90%人群，可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、鼻咽癌以及移植后淋巴增生性疾病[1]。EBV又稱人類皰疹病毒4型，為雙鏈DNA病毒，分為A、B兩型，亞洲主要以A型為主。EBV感染急性期血清學(xué)診斷主要通過檢測針對(duì)病毒衣殼抗原(VCA)的IgM抗體來確定[2]。ELISA是診斷EBV感染最靈敏的方法，目前應(yīng)用最為廣泛的是利用EBV培養(yǎng)液獲取的天然抗原來捕獲患者血清中的IgM或IgG[3]。有些ELISA方法利用了重組EBV核蛋白及重組早期蛋白D抗原[4]。然而EBV很多重要抗原都是由兩個(gè)到六個(gè)蛋白組成的復(fù)雜蛋白，常高度糖基化，這些嚴(yán)重阻礙了重組抗原在商業(yè)診斷試劑中的應(yīng)用。用一個(gè)代表抗體結(jié)合位點(diǎn)的多肽來替代整個(gè)蛋白，將是EBV診斷抗原研發(fā)的一個(gè)新方向。

多肽表位在診斷抗原上的應(yīng)用允許表位的篩選可以只關(guān)心與目標(biāo)抗體結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的表位，盡量避免與診斷無關(guān)表位的摻入。多肽，不像重組抗原那么復(fù)雜，同樣可以模擬碳水化合物表位[5]。很多研究曾篩選出很多病原體的多肽表位，但主要是連續(xù)性表位或者是線性抗體結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)功能性血清抗體都只能與構(gòu)象型或非連續(xù)表位反應(yīng)，因此這種多肽的篩選通過簡單的重疊多肽表位篩選法很難獲取。Casey等[2]利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選出了與EBV免疫顯性抗原表位關(guān)聯(lián)的多肽，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些多肽在診斷上完全可以替代復(fù)雜蛋白質(zhì)抗原的想法。并將此多肽命名為模擬表位(mimotopes)，意指可以模擬表位的必要特征(主要是與相應(yīng)抗體結(jié)合的特征)而不必要與真實(shí)表位序列相同。

本研究基于模擬表位的發(fā)現(xiàn)，將四個(gè)模擬表位串聯(lián)起來，利用原核表達(dá)系統(tǒng)和層析純化技術(shù)獲得EBV感染的診斷抗原，并以此建立EBV-IgM抗體捕獲法ELISA，來鑒定EBV的急性感染。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為本科室現(xiàn)存和Trx融合表達(dá)載體M48為本科室構(gòu)建(圖1)。限制酶Nco I和Xho I以及T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，STREAMLINE Chelating親和層析介質(zhì)及DEAE Sepharose Fast Flow購自美國GE公司，鼠抗Trx單克隆抗體、羊抗鼠IgG-HRP和羊抗人IgM-HRP均購自美國Merck Millipore公司。EBV急性期血清50份，陰性血清50份來源于臨床和實(shí)驗(yàn)室確診人群。

1.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將EBV模擬表位GP125、F1、A2及 A3C2多肽序列(表1)用短肽連接臂(SAPGTPSR)進(jìn)行串聯(lián)，優(yōu)化密碼子后全基因合成。用限制酶Nco I和Xho I處理攜帶目的片段的pMD-19T，切膠回收并定量目的片段。將其連接到相同酶切處理的M48載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。次日挑取白色單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送公司測序并同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定。測序和雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒命名為H58質(zhì)粒。

1.3 目的蛋白的表達(dá)和純化 將H58質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，構(gòu)建表達(dá)工程菌。挑取單菌落接種于含氨芐霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基(10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取液，10 g/L NaCl)中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h后加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)2 h，離心(6 000×g，5 min，4℃)收集菌體沉淀。用超純水重懸后加入等倍體積2×loading buffer后SDS-PAGE即為目的蛋白的小量表達(dá)[6]。將表達(dá)工程菌1∶1000接種，37℃培養(yǎng)10 h后，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5 h后離心收菌(3 000×g，10 min，4℃)即為目的蛋白的大量表達(dá)。用溶液I(10 mmol/L Tris-HCl， 0.5%Triton X-100， pH 8.0)重懸菌體沉淀后超聲破碎(300～20 s～20 s～30次)，離心(174 000×g，10 min，4℃)收集包涵體沉淀。包涵體沉淀用溶液Ⅰ洗2次后，用5 ml超純水進(jìn)行重懸。將重懸液加入到45 ml溶液Ⅱ(10 mmol/L Tris-HCl，7 M鹽酸胍，pH 8.0)中混勻并室溫靜止10 min。離心(174 000×g，10 min，4℃)收集上清。將其上樣于溶液Ⅱ平衡的親和層析介質(zhì)中。并分別用0 mmol/L，30 mmol/L，60 mmol/L 咪唑(溶于溶液Ⅱ中)進(jìn)行梯度洗脫。其后用溶液Ⅲ(10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0)再次平衡層析體系。待平衡后，用60 mmol/L，300 mmol/L咪唑(溶于溶液Ⅲ中)進(jìn)行梯度洗脫。分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察目的蛋白的含量以及分布情況。將目的蛋白含量(濃度)最高，目的蛋白百分占比(純度)最高的洗脫液于于0% ～100% 溶液IV(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中徹底透析。

DEAE陰離子交換介質(zhì)用基液IV平衡后將透析液上樣，分別用 0 mmol/L，100 mmol/L，200 mmol/L，400 mmol/L NaCl(溶于基液IV中)進(jìn)行梯度洗脫并收集相應(yīng)洗脫液。取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察目的蛋白的含量以及分布情況。

1.4 目的蛋白的鑒定 利用基于非變性PAGE的Western blot技術(shù)對(duì)H58蛋白抗原性進(jìn)行鑒定[6]。簡言之，10μl H58蛋白進(jìn)行13.5% 非變性PAGE電泳(恒流45 mA，45 min)，而后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(NC)(恒壓15 V，30 min)上。其后NC膜用封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST)封閉過夜。次日分別加入鼠抗 Trx 單克隆抗體(1∶5000；Merck Millipore)、EBVIgM 陽性血清(1∶10)、EBV-IgM 陰性血清(1∶10)。檢測抗體對(duì)應(yīng)為羊抗鼠IgG-HRP(1∶4 000；Merck Millipore)和羊抗人 IgM-HRP(1∶4 000；Merck Millipore)。最后DAB顯色，清水終止顯色。

1.5 H58-HRP偶聯(lián)反應(yīng) 為了檢測血清中的IgM抗體，我們建立了捕獲法ELISA。檢測抗原需要偶聯(lián)HRP，便于顯色。H58-HRP偶聯(lián)反應(yīng)按照說明書操作(KPL，MD，USA)[6]。簡言之，透析處理H58，而后調(diào)整蛋白濃度為2.0 mg/ml。然后逐滴加入預(yù)活化的HRP(HRP:H58≈3∶1)。4℃孵育過夜后加入10μl Reducing Agent(NaCNBH3)，室溫孵育15 min終止反應(yīng)。最終加入等體積2×HRP Storage Buffer，室溫孵育15 min后，4℃保存?zhèn)溆谩＠弥苯臃‥LISA滴定鼠抗Trx單克隆抗體和H58-HRP來評(píng)價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)效率[6]。簡言之，用碳酸鹽包被緩沖液(CB)二倍系列稀釋鼠抗Trx單克隆抗體(1∶250～1∶16000)后包被微孔，封閉處理后待用。加入用PBS二倍系列稀釋的H58-HRP(1∶250～1∶16000)孵育。 洗滌后加入50μl TMB(MP，CA，USA)孵育 10 min。 加入 50μl H2SO4(1 mol/L)終止反應(yīng)。參考基線波長為620 nm，監(jiān)測波長為450 nm用酶標(biāo)儀測定每個(gè)孔的吸收度值(OD值)。

1.6 目的蛋白診斷效能的評(píng)價(jià) 利用H58-HRP建立血清EBV-IgM抗體捕獲法ELISA試劑盒，并對(duì)臨床和實(shí)驗(yàn)室確診的血清樣本進(jìn)行檢測，以此評(píng)價(jià)試劑盒對(duì)陰陽性血清標(biāo)本的鑒別能力[6]。簡言之，用抗μ-二抗(1∶500于CB中)包被微孔，封閉后待用；分別加入待測血清后37℃孵育40 min(1:20稀釋，每個(gè)樣本設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔)；洗滌后加入H58-HRP偶聯(lián)物(1∶2000稀釋)，置37℃孵育30 min；洗滌后加入 TMB顯色，用酶標(biāo)儀測定 OD值。臨界值(cutoff值)定義為陰性樣本OD值平均數(shù)的2.1倍。

2 結(jié)果

2.1 目的蛋白的構(gòu)建與表達(dá)純化 H58在M48載體多克隆位點(diǎn)上的結(jié)構(gòu)如圖1，H58蛋白自氨基端到羧基端順序?yàn)?Trx前導(dǎo)肽，GP125、F1、A2及A3C2模擬表位(表1)，及HisTag，各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間添加了短肽連接臂(SAPGTPSR)以及特點(diǎn)酶切位點(diǎn)(圖1)。

圖1 H58表達(dá)質(zhì)粒示意圖Fig.1 Schematic diagram of H58 expression plasmids

Trx表達(dá)載體經(jīng)雙酶切處理(Nco I和Xho I)后獲得一條長5 849 bp的線性化載體。H58F-pMD-19T經(jīng)雙酶切處理(Nco I和Xho I)后獲得一條長350 bp的線性化片段。載體和片段用連接酶進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測序并進(jìn)行雙酶切鑒定。測序及雙酶切鑒定結(jié)果證實(shí)成功插入的質(zhì)粒，命名為H58質(zhì)粒。

H58蛋白小量表達(dá)SDS-PAGE電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，，在約26×103處有明顯條帶(圖2.A)，與預(yù)測蛋白大小(26.3×103)一致。H58蛋白大量表達(dá)后，目的蛋白主要以包涵體形式存在于菌體超聲液的沉淀中(圖2.B)，且目的蛋白占菌體總蛋白的含量達(dá)到36.01%。第一步親和層析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H58蛋白在300 mmol/L咪唑洗脫液中的濃度和純度最好(圖2.B)，其中濃度為3.6 mg/ml，純度為98.33%。將此洗脫液經(jīng)過完全透析復(fù)性。第二步陰離子交換層析結(jié)果發(fā)現(xiàn)H58蛋白在200 mmol/L NaCl洗脫液中濃度和純化最好，分別為濃度 2.8 mg/ml，純度99.01%(圖2.B)。

2.2 目的蛋白的鑒定 為了評(píng)價(jià)H58蛋白的完整性及抗原性，我們用抗Trx單克隆抗體以及EBV感染陽性血清作為捕獲抗體。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，捕獲抗體為鼠抗Trx標(biāo)簽抗體(圖3.A)以及EBVIgM陽性血清(圖3.B)，在NC膜上約26×103處(與預(yù)測大小一致)都出現(xiàn)了條帶；而捕獲抗體為EBV-IgM陰性血清，在NC膜上無任何條帶。證明了H58蛋白的完整性以及抗原性。

圖2 H58蛋白小量表達(dá)(A)，親和層析及陰離子交換層析純化結(jié)果(B)Lane 1， negative control； lane2-6， expression of 6 single-colonies； lane 7， total bacterial proteins after sonication； lane 8， soluble fraction of the homogenate； lane9， insoluble fraction of the homogenate； lane10， elute washed with 300 mmol/Limidazole； lane11， elutes washed with 200 mmol/L NaClFig.2 The small-scale prokaryotic expression(A)and purification of H58 protein by affinity and DEAE chromatography(B)

圖3 H58的Western blot分析A.Mouse anti-Trx monoclonal antibody as capture antibody， Goat anti-Mouse IgG-HRP conjugate as detection antibody； B.EBV-IgM positive serum as capture antibody， Goat anti-human IgM-HRPconjugate as detection antibody； C.EBV-IgM negative serum as capture antibody， Goat anti-human IgM-HRP conjugate as detection antibody.1.Non-induced bacteria；2.Purified H58 proteinFig.3 Western blot analysis of H58 protein

2.3 目的蛋白診斷效能的評(píng)價(jià) 基于H58-HRP偶聯(lián)蛋白我們建立了EBV-IgM抗體檢測ELISA試劑盒，對(duì)50份EBV-IgM陽性血清和50份EBV-IgM陰性血清樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性血清樣本與陰性血清樣本OD值分布分別為1.352(95%CI:1.233～1.489)和0.135(95%CI:0.113～0.159)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。近而粗略估計(jì)試劑盒的臨界值為0.284。按照此臨界值確定陰陽性結(jié)果，得出表2結(jié)果，以此數(shù)據(jù)得出靈敏度為98.0%，特異性為96.0%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)χ2=0.00，P＞0.05，尚不能說明兩種診斷方法差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC分析曲線下面積為0.991(95%CI:0.981～1.022)，一致性檢驗(yàn)kappa值為0.940，表明兩種檢測方法一致性優(yōu)異。由此得出，基于H58抗原的EBV-IgM抗體診斷捕獲法ELISA試劑盒可以很好地鑒別EBV感染陰陽性血清樣本。

表2 捕獲法ELISA檢測結(jié)果Tab.2 The results of capture ELISA kit

3 討論

模擬表位打破了傳統(tǒng)表位的概念，并不局限于目標(biāo)抗體結(jié)合蛋白的氨基酸序列，僅僅要求其可以與目標(biāo)抗體反應(yīng)即可。利用模擬表位作為診斷試劑的概念基于抗體靶向一個(gè)病原體許多免疫顯性表位的可能性[2]。事實(shí)上，早就有在原因目標(biāo)抗原未知的情況下利用噬菌體表面展示技術(shù)來鑒定多肽的報(bào)道[6]。而且利用噬菌體表面展示技術(shù)鑒定的多肽已經(jīng)被作為抗原探針，成功應(yīng)用于乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的免疫學(xué)診斷中[8-9]。這種方法的成功依賴于多肽可以模擬天然抗原免疫顯性表位的能力。在Casey的研究中已經(jīng)證實(shí)，本研究所選用的這四個(gè)模擬表位(GP125、F1、A2及A3C2)獨(dú)自存在時(shí)的診斷價(jià)值。本研究旨在希望通過串聯(lián)表達(dá)四個(gè)模擬表位來提高診斷試劑的靈敏度和特異性，以及降低診斷抗原制備的時(shí)間和成本。

考慮到四個(gè)模擬表位短小，構(gòu)建時(shí)將其融合了Trx標(biāo)簽。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了目的蛋白可以很好地在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，而且通過親和層析、逐級(jí)復(fù)性以及離子交換層析可以獲取水溶性良好的目的蛋白?；诜亲冃訮AGE的Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了H58蛋白可以與EBV-IgM陽性血清中的相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)，有力支持了H58蛋白作為診斷抗原的潛能。H58與HRP的偶聯(lián)，Trx前導(dǎo)肽還有吸引HRP偶聯(lián)位點(diǎn)的擔(dān)當(dāng)，有效避免了HRP偶聯(lián)帶來的抗原效價(jià)降低或失活，為成品試劑盒的研發(fā)鑒定了基礎(chǔ)。

總之，我們將EBV四個(gè)模擬表位進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，利用親和層析和離子交換層析成功獲取了帶有Trx前導(dǎo)肽和His后綴標(biāo)簽的診斷抗原，并將其成功應(yīng)用于EB病毒新近感染和急性感染的診斷，為成品試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 無