郭寒冰 焦長林 孫允芹 李 彤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

近年來，人肝細(xì)胞生長因子重組腺病毒(Ad-HGF)作為一種新型基因定植藥物，在血管新生方面的作用引起廣泛關(guān)注，目前研究發(fā)現(xiàn)Ad-HGF有促進(jìn)腦血管新生的作用〔1〕。隨著人們生活水平的提高，高血壓高血脂成為老年人各種疾病的導(dǎo)火索。本研究觀察向老齡高血壓高血脂大鼠枕大池內(nèi)注射Ad-HGF后大鼠腦組織炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-10及核因子(NF)-κBp65表達(dá)的變化，驗(yàn)證外源性Ad-HGF作用于老齡高血壓高血脂大鼠腦組織的安全性。

1 材料與方法

1.1主要的試劑和儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(新加坡，Life Technologies)；Ad-HGF(滴度5×109pfu/100 μl，北京奧洛英)；微量注射器；高脂飼料(膽固醇、丙基硫氧嘧啶、膽酸鈉、蛋白粉、蔗糖、蛋黃粉、豬油)；大鼠腦立體定位儀(淮北，正華)；大容量離心機(jī)(德國，Hettich)；一抗抗體兔抗鼠IL-10抗體(武漢博士德，BA1201-1)；一抗抗體兔抗鼠NF-κBp65抗體(萬類生物，WL01980)；IL-10上游引物：5′-CAG TCA GCC AGA CCC ACA T-3′，下游引物：5′-GCT CCA CTG CCT TGC TTT-3′，片段長度141 bp；NF-κBp65上游引物：5′-GGC AGC ACT CCT TAT CAA C-3′，下游引物：5′-GGT GTC GTC CCA TCG TAG-3′，片段長度247 bp。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague Dawley大鼠，120只，250～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔SCXK(京)2012-0001〕，12 h明暗交替，飲水?dāng)z食自由。隨機(jī)分為假手術(shù)組、老齡高血壓高血脂大鼠模型組、老齡高血壓高血脂模型組枕大池注入Ad-HGF后10 d組、20 d組、30 d組各20只。

1.3實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?使用10%水合氯醛麻醉大鼠后固定，腹正中線偏左肋弓下緣2 cm處切開，找到左腎靜脈，剝離并用血管線穿過腎靜脈，同時(shí)放入約1.5 cm的針灸針，將線打結(jié)后拔出，用同樣的方法行右腎靜脈狹窄術(shù)，術(shù)后閉合腹腔。普通飼料喂養(yǎng)2 w后，測量大鼠血壓(剔除不符合檢驗(yàn)指標(biāo)大鼠11只)，觀察到模型組血壓明顯增高。高血壓造模成功后高脂飼料喂養(yǎng)(0.2%丙基硫氧嘧啶，2%膽固醇，5%豬油，0.25%白糖，0.35%膽酸鈉)16 w。高血脂造模成功標(biāo)準(zhǔn)：抽取大鼠靜脈血測得血脂升高，取大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察到頸內(nèi)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，有粥樣斑塊形成。假手術(shù)組分離左右腎動(dòng)脈，不行腎動(dòng)脈狹窄術(shù)，術(shù)后正常飼料喂養(yǎng)。造模完成后，假手術(shù)組通過枕大池注入生理鹽水，老齡高血壓高血脂模型組大鼠通過枕大池注入生理鹽水，注藥后10 d、20 d、30 d組為模型組大鼠通過枕大池注入Ad-HGF(10 μl，滴度5×109pfu/100 μl)后分別于第10天、20天、30天處死。

1.4血壓、血脂濃度測定 使用ML125/R制備的鼠尾套測得假手術(shù)組與模型組血壓，發(fā)現(xiàn)模型組血壓明顯升高，證明高血壓模型建造成功，抽樣抽取假手術(shù)組與模型組大鼠尾靜脈血，測量血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，發(fā)現(xiàn)血清TC、TG、LDL-C明顯增高，而HDL-C明顯降低，證明高血脂模型建造成功。

1.5免疫組織化學(xué)標(biāo)本制備 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后暴露心臟，從心尖部插入粗針頭使針頭到達(dá)主動(dòng)脈弓，同時(shí)剪開右心耳使靜脈血流出，心臟灌注觀察直到有清亮液體流出，隨后4%多聚甲醛灌注固定組織，快速分離完整腦組織放入多聚甲醛固定液，于24 h后制作蠟塊，石蠟切片機(jī)切取3 μm厚的腦片。

1.6免疫組織化學(xué)法檢測IL-10、NF-κBp65陽性細(xì)胞表達(dá) 腦片經(jīng)過二甲苯脫蠟、枸櫞酸鈉微波修復(fù)、Triton增加膜的通透性、加入一抗4℃在濕盒中過夜、二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色等步驟得到免疫組織化學(xué)陽性表達(dá)結(jié)果。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IL-10、NF-κBp65 mRNA的表達(dá) 10%水合氯醛麻醉，快速取出腦組織，液氮罐預(yù)冷后-80℃冰箱保存。研缽中倒入液氮，研磨組織成粉，Trizol法提取總的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。目的基因相對表達(dá)量采用2-△△CT進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般狀態(tài) 模型組大鼠表現(xiàn)為精神萎靡、毛發(fā)無光澤、活動(dòng)遲緩、體重升高。經(jīng)枕大池注入Ad-HGF后精神狀態(tài)改善、飲食良好。

2.2大鼠體重及血脂變化 與假手術(shù)組相比，模型組收縮壓(SBP)明顯升高(P<0.05)，說明雙側(cè)腎動(dòng)脈狹窄術(shù)所導(dǎo)致的高血壓模型建造成功，模型組TC、LDL-C、TG水平顯著增加，HDL-C水平顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 假手術(shù)組與模型組SBP及血漿脂蛋白比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05

2.3各組海馬CA1區(qū)IL-10、NF-κBp65陽性細(xì)胞數(shù)比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，假手術(shù)組有少量IL-10表達(dá)，而模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，注藥后10 d組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且注藥后20 d組達(dá)到高峰，注藥后30 d組開始呈下降趨勢。與假手術(shù)組相比，模型組NF-κBp65表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，注藥后10 d、20 d組呈遞減趨勢(P<0.05)，注藥后30 d組與20 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，表2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)IL-10、NF-κBp65陽性細(xì)胞數(shù)(免疫組化染色，×200)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)IL-10、NF-κBp65陽性細(xì)胞數(shù)比較個(gè)/HP,n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與注藥后10 d組比較:3)P<0.05，同表3

2.4各組大鼠海馬區(qū)IL-10、NF-κBp65 mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組IL-10 mRNA表達(dá)顯著減少，而NF-κBp65 mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，注藥后10 d、20 d、30 d組IL-10 mRNA表達(dá)顯著增加，NF-κBp65 mRNA表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠海馬IL-10、NF-κBp65 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

肝細(xì)胞生長因子(HGF)具有強(qiáng)烈的促進(jìn)血管新生的作用〔1～4〕，而沒有組織水腫、低血壓等問題〔5〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以改善心肌缺血〔6〕，增加IL-10的表達(dá)，對心臟組織沒有明顯的毒性和誘變作用〔7〕。同時(shí)，HGF可以抑制由于腦組織損傷而產(chǎn)生的纖維化〔8，9〕，緩解由于腦供血不足導(dǎo)致的各種臨床癥狀及后遺癥。研究發(fā)現(xiàn)，將帶有HGF的野生型病毒(HVJ)注入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔后腦部新生血管明顯增多〔10〕。

隨著HGF被廣泛研究，我國構(gòu)建了具有專利技術(shù)的Ad-HGF，它是一種新型的基因定植藥物(腺病毒載體為E1、E3缺失體)，避免了野生型腺病毒的復(fù)制產(chǎn)生〔11〕。新型藥物Ad-HGF的研發(fā)及其對組織缺血的療效〔12〕，使其在高血壓高血脂所造成的缺血性腦血管病中的應(yīng)用得以關(guān)注。但由于腦組織結(jié)構(gòu)的特異性，需要通過檢測藥物進(jìn)入腦組織后炎癥因子的表達(dá)，推測藥物作用于腦組織的安全性。本文通過建造老齡高血壓高血脂大鼠模型〔13〕，建立穩(wěn)定的與高齡人群高血壓高血脂導(dǎo)致的腦缺血相似的病理改變。成功建立模型后，通過枕大池注入Ad-HGF，使HGF進(jìn)入腦脊液循環(huán)中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明，向大鼠枕大池注入Ad-HGF后，大鼠腦組織抗炎的炎癥因子IL-10水平升高，而NF-κBp65水平降低。

研究證明，IL-10〔14〕在動(dòng)脈粥樣硬化中占據(jù)重要位置，調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖，抑制促炎的炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等的炎癥反應(yīng)〔15〕，可以緩解動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展并促進(jìn)組織損傷的愈合。而NF-κBp65〔16〕為NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核中的一個(gè)亞基，p65轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核后會(huì)增強(qiáng)受損組織的炎癥浸潤，且參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制〔17〕。本研究結(jié)果說明藥物注入腦組織后減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了由于高血脂高血壓造成的大鼠腦組織的損傷修復(fù)。

有研究顯示〔18〕，將Ad-HGF重復(fù)注入大鼠心臟衰竭模型的心肌組織中，新生血管密度明顯增加、心臟功能明顯改善。因此，計(jì)劃采用反復(fù)多次的注藥方式延長藥物作用時(shí)間，同時(shí)將從大鼠生存周期、記憶力等方面繼續(xù)驗(yàn)證Ad-HGF對于腦組織作用的安全性。