張莉莉，何馳華，張楊

(長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院生殖中心， 湖北 荊州 434020)

囊胚的擴張、孵化程度及囊胚的分級是妊娠結(jié)局的重要影響因素。研究報道，臨床妊娠率會隨著囊胚擴張和孵化程度的增加而增加，也就是說，3-5期囊胚的臨床妊娠率顯著高于1-2期囊胚，非優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床妊娠率顯著降低[1]。在本中心，對多次移植失敗的高齡婦女行囊胚培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ期囊胚的形成幾率較大，達到43.42%(132/304)。輔助孵化(assisted hatching, AH)應(yīng)用到人類輔助生殖技術(shù)中已有多年，其與激光系統(tǒng)的聯(lián)合運用取得了良好的效果[2]。Hsieh等研究發(fā)現(xiàn)，激光輔助孵化可以顯著提高胚胎種植率、妊娠率及分娩率[3]。同時，Blake的研究更是表明激光法還可以顯著提高囊胚的孵出率[4]?；谏鲜鲅芯?，對我院生殖中心2015年7月至2017年2月Ⅰ、Ⅱ期囊胚移植81個周期進行了回顧性分析，比較了激光輔助孵化后移植和常規(guī)移植患者的囊胚種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率，探討了激光輔助孵化對Ⅰ、Ⅱ期囊胚種植潛力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2015年7月1日至2017年2月17日在我院生殖中心接受凍融胚胎囊胚培養(yǎng)形成Ⅰ、Ⅱ期囊胚的高齡患者(≥35歲)的81個周期。經(jīng)患者夫婦同意行激光輔助孵化后移植41周期(AH組)，其余40周期行常規(guī)胚胎移植(常規(guī)組)。

激光破膜儀系德國MTG公司生產(chǎn)；Jy-T解凍液購自加拿大Jy公司；囊胚培養(yǎng)基K-SIBM-20由Cook公司生產(chǎn)；胚胎培養(yǎng)基HTF-1026由SAGE公司生產(chǎn)；代血清由SAGE公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1) 玻璃化解凍胚胎 玻璃化解凍試劑室溫下平衡30min，室溫下操作，快速從液氮桶中取出載桿，將胚胎放入T1中停留1～3min，室溫下操作，將胚胎轉(zhuǎn)入T2中停留3min，室溫下操作，將胚胎轉(zhuǎn)入T3中停留3min。緩慢復(fù)溫從室溫至37℃，將胚胎轉(zhuǎn)入T4中停留3min，將胚胎轉(zhuǎn)入1026 HTF移植液中，并對胚胎進行形態(tài)學(xué)觀察，置入cook三氣培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2h后移植。在顯微鏡下挑出存活胚胎(≥50%完整卵裂球)，解凍后的胚胎評分標準同冷凍前，將一部分死亡的卵裂球標記為碎片，含一半以上存活卵裂球的胚胎記為活胚。

2)囊胚培養(yǎng) 將上述解凍后存活的D3胚胎移入囊胚培養(yǎng)液K-SIBM-20中繼續(xù)培養(yǎng)2d。

3)輔助孵化 移植前1h，AH組采用1.48μm非接觸式激光(Annexin laser,德國)薄化透明帶。將待移植胚胎置于20倍倒置鏡下，選擇卵周隙大或者碎片集中的區(qū)域，調(diào)整激光靶心，形成一個約相當于透明帶總長度1/4、深度為透明帶總厚度50%～80%的薄化區(qū)，將輔助孵出后的胚胎放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待移植。

4)囊胚移植和妊娠結(jié)果的判斷 囊胚分級：胚胎等級評分按Garnder標準，主要根據(jù)囊胚擴張等級和孵出程度、內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)外胚層細胞三個主要方面評分，根據(jù)囊腔的擴張孵化將囊胚分為1～6級。1級：囊腔體積<胚胎總體積的1/2；2級：囊腔體積≥胚胎總體積的1/2；3級：囊腔占滿胚胎的總體積；4級：囊腔充滿整個胚胎，胚胎體積變大，透明帶變?。?級：正在孵出的囊胚，滋養(yǎng)層從透明帶逸出；6級：囊胚完全從透明帶中孵出。對3～6期的囊胚，內(nèi)細胞團的評分：A級細胞數(shù)量多且排列緊密；B級細胞數(shù)量較少且排列松散；C級為細胞數(shù)量極少。滋養(yǎng)外胚層細胞評分：A級細胞數(shù)量多且結(jié)構(gòu)致密；B級細胞數(shù)量不多且結(jié)構(gòu)稀疏；C級細胞數(shù)量很少。≥3BB定義為優(yōu)質(zhì)囊胚，如有多個囊胚可供移植，一般選擇3期以及3期以上囊胚進行移植，但當患者多次移植失敗且高齡時或者其僅有1期和2期囊胚時，也可移植非優(yōu)質(zhì)囊胚。移植后12d測尿hCG，陽性者移植后4周行超聲檢查，若子宮腔內(nèi)見妊娠囊和原始心管搏動即可以確定為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本情況

兩組患者年齡，不孕原因分布，接受IVF治療的次數(shù)，平均移植Ⅰ、Ⅱ期囊胚數(shù)，透明帶平均厚度及子宮內(nèi)膜厚度均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表1)。

表1 兩組患者的基本情況

2.2 兩組患者的Ⅰ、Ⅱ期囊胚種植率

AH組患者移植Ⅰ、Ⅱ期囊胚數(shù)共計67個，其中著床胚胎數(shù)為18個，AH組囊胚種植率為26.87%。常規(guī)組患者移植Ⅰ、Ⅱ期囊胚數(shù)共計64個，其中著床胚胎數(shù)為7個，常規(guī)組囊胚種植率為10.94%。 AH組患者Ⅰ、Ⅱ期囊胚種植率明顯高于常規(guī)組，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 兩組患者的臨床妊娠率

AH組Ⅰ、Ⅱ期囊胚移植周期數(shù)為41例，其中妊娠周期數(shù)為14例，AH組臨床妊娠率為34.15%。常規(guī)組Ⅰ、Ⅱ期囊胚移植周期數(shù)為40例，其中妊娠周期數(shù)為7例，常規(guī)組臨床妊娠率為17.50%。 AH組患者臨床妊娠率明顯高于常規(guī)組，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 兩組患者的活產(chǎn)率

AH組Ⅰ、Ⅱ期囊胚移植周期數(shù)為41例，其中活產(chǎn)分娩周期數(shù)為10例，AH組活產(chǎn)率為24.39%。常規(guī)組Ⅰ、Ⅱ期囊胚移植周期數(shù)為40例，其中活產(chǎn)分娩數(shù)為6例，常規(guī)組活產(chǎn)率為15.00%。 AH組患者的活產(chǎn)率高于常規(guī)組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

囊胚培養(yǎng)技術(shù)始于20世紀90年代，隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，囊胚培養(yǎng)技術(shù)也隨之不斷改進與完善。由于囊胚相對卵裂期胚胎延長了體外培養(yǎng)時間，可在一定程度上對攜帶有遺傳缺陷或低發(fā)育潛能的胚胎進行初步篩選和淘汰，而能夠發(fā)育至囊胚的胚胎具有更高的發(fā)育潛能和臨床種植能力，可獲得更高的臨床妊娠率[5]。臨床妊娠率隨著囊胚的擴張和孵化程度的增加而增加，部分研究雖然沒有對不同擴張和孵化程度的囊胚進行臨床妊娠率的比較，但也表明了移植評分高的囊胚及卵裂期胚胎可獲得更高的臨床妊娠率[6～8]。然而，本生殖中心對移植失敗2次及2次以上的患者行冷凍胚胎凍融后囊胚培養(yǎng)，最終大部分只形成了Ⅰ期囊胚或者Ⅱ期囊胚(非優(yōu)質(zhì)囊胚)。其中AH組41個周期共解凍了155個D3胚胎，形成Ⅰ期和Ⅱ期囊胚共67個；常規(guī)組40個周期共解凍了149個D3胚胎，形成Ⅰ期和Ⅱ期囊胚共65個。兩組Ⅰ、Ⅱ期囊胚形成率約為43.42%。

1995年Germond等[9]初次運用1.48μm二極管非接觸式激光在鼠胚透明帶上打孔，建立了安全并有效的胚胎AH程序，隨后很多研究也證實了激光法是一種安全有效、操作簡便的AH方法[4,10]。激光輔助孵化分為透明帶打孔和削薄兩種方式，透明帶打孔會破壞其對內(nèi)細胞團的保護。若打孔孔徑較小，胚胎孵化不能進行自然薄化而致“8”字型孵化,胚胎將無法完全孵出易發(fā)生嵌頓[4]；若打孔孔徑較大,胚胎提前孵化而致另一相同胚胎的形成,即同卵雙生[11]。因此，對孔徑大小的把握在透明帶打孔的運用中也很關(guān)鍵。另有研究報道，囊胚期采用激光破膜技術(shù)進行AH，可避免囊胚的機械性損傷[12]。因為胚胎發(fā)育至囊胚時，體積擴張，滋養(yǎng)層細胞與透明帶結(jié)合較緊，此時的囊胚腔不能耐受外界擠壓，若采用機械的AH易造成囊胚腔破裂。另外，囊胚的滋養(yǎng)細胞數(shù)目較多且已分化，打孔部位有外滋養(yǎng)層保護，不會傷及到內(nèi)細胞團，故對胚胎的影響也不大。所以，胚胎位于囊胚期進行AH更加符合生理[13]。遲琳琳等發(fā)現(xiàn)，激光破膜技術(shù)的AH，有助于胚胎孵化，很大程度增加著床的可能性。針對連續(xù)兩次或兩次以上移植失敗的患者，本中心解凍Day3的冷凍胚胎繼續(xù)培養(yǎng)2d待囊胚形成，并在移植前進行AH，發(fā)現(xiàn)激光破膜術(shù)有助于提高Ⅰ、Ⅱ期囊胚的種植率和臨床妊娠率。目前，年齡是已知的影響體外受精治療成功率的重要因素之一，隨著女性年齡的不斷增大，其卵巢儲備庫卵母細胞數(shù)目、質(zhì)量和貯存能力均在逐步減退[14，15]。本研究中，患者年齡均≥35歲，高齡、胚胎冷凍復(fù)蘇和體外培養(yǎng)時間較長，三重影響使透明帶變硬、彈性變小，進而影響囊胚擴張和透明帶破裂導(dǎo)致孵出困難[16]。若對胚胎進行AH，則有助于囊胚的孵出，促使其種植，提高妊娠率。另外，透明帶厚度、子宮內(nèi)膜環(huán)境等均可能影響胚胎孵出和種植率。在本研究中，兩組患者其他影響因素之間均無顯著差異，AH組Ⅰ、Ⅱ期囊胚的種植率為26.87%，臨床妊娠率為34.15%，均高于常規(guī)組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。但最新有研究證明激光法并不能提高臨床妊娠率[17]，本研究與其不一致，后續(xù)需要加大臨床樣本量，仍需要開展更多的臨床對照實驗。AH組41周期中活產(chǎn)10例，活產(chǎn)率為24.39%；常規(guī)組40周期中活產(chǎn)6例，活產(chǎn)率為15.00%。兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。與最新meta分析的結(jié)果[17]即AH不能增加胚胎活產(chǎn)率一致，但AH能否提高Ⅰ、Ⅱ期囊胚的活產(chǎn)率并未見報道。 雖然有研究報道激光打孔會提高囊胚的嵌頓率,但本研究中未發(fā)現(xiàn)。另外，可能是因為打孔孔徑過大，在本研究中，同卵雙生發(fā)生1例。

綜上所述，對于多次移植失敗的高齡(≥35歲)患者，激光破膜術(shù)有助于提高非優(yōu)質(zhì)囊胚的種植率和臨床妊娠率，因此對于多次移植失敗的高齡患者或者胚胎質(zhì)量欠缺的患者有必要進行Ⅰ、Ⅱ期囊胚的移植和激光破膜術(shù)的應(yīng)用。本研究存在臨床樣本量小的特點，未來需要加大樣本量，加強研究，以進一步了解輔助孵化與臨床結(jié)局(活產(chǎn)率)的關(guān)系，進而為廣大高齡婦女和妊娠結(jié)局不良的患者帶來福音。