王繼兵 陳 君

（1 湖北省襄陽(yáng)市谷城縣廟灘中心衛(wèi)生院，湖北 襄陽(yáng) 441721；2 湖北省襄陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北 襄陽(yáng) 441021）

清開(kāi)靈注射液是由膽酸、板藍(lán)根、黃芩苷等8味中草藥制成，有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒腦開(kāi)竅的功效，臨床上使用很普遍。但目前該藥在2015年版藥典仍沿用家兔法檢測(cè)熱原，家兔法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、成本高，靈敏度低，我們根據(jù)2015年版藥典四部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和熱原家兔法的要求[1]，對(duì)該藥進(jìn)行了檢測(cè)研究對(duì)比，結(jié)果表明，清開(kāi)靈注射液可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔法檢測(cè)熱原，但是應(yīng)考慮到藥物對(duì)試驗(yàn)的干擾。

1 儀器與材料

1.1 儀器：旋渦式混懸器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠，ZH-2型）；電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市中大儀器廠，420型）；無(wú)熱源移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 材料：鱟試劑2個(gè)規(guī)格，各2批（湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.5 Eu/mL，批號(hào)1504152，批號(hào)1608291，靈敏度0.25 Eu/mL，批號(hào)1612091，批號(hào)1703151），細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水（湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格5.0 mL，批號(hào)1506080），細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格10 Eu/支，批號(hào)1507080）。熱原用家兔，健康并經(jīng)預(yù)測(cè)合格，清開(kāi)靈注射液（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)16080421、17011722）

2 方法與結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素限值的確定：按中國(guó)藥典2015年版4部1143規(guī)定，藥品、生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）按以下公式確定：L=K/M，K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素計(jì)量，注射劑K=5 Eu/（kg·h），M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量，清開(kāi)靈注射液的用法用量中一次最大注射量為40 mL，藥典規(guī)定人均體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，注射時(shí)間按1 h計(jì)算，則M=40 mL/（60 kg×1 h）=0.667 mL/（kg·h），以此計(jì)算出清開(kāi)靈注射液內(nèi)毒素的限值（L）=5 Eu/（kg·h）/0.667mL/（kg·h）＝7.5 Eu/mL。

2.2 確定最大有效稀釋倍數(shù)MVD：藥典規(guī)定MVD=cL/λ，其中c為供試品溶液的濃度，這里依據(jù)藥典，c=1.0mL/mL，在上一部分我們已經(jīng)根據(jù)清開(kāi)靈注射液的使用說(shuō)明和藥典規(guī)定計(jì)算出L=7.5 Eu/mL，我們常用的鱟試劑靈敏度為0.5 Eu/mL，計(jì)算出MVD=cl/λ=15。

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：2015年版藥典規(guī)定，當(dāng)使用了新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。將10 Eu/支的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水1.0 mL溶解并在旋渦混合器上混勻15 min后，依法制成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋方法如下：

每個(gè)濃度平行做4支管，再加上兩支陰性對(duì)照管，每個(gè)批次鱟試劑一共18支管，按2015版藥典四部操作，本次試驗(yàn)所用的鱟試劑復(fù)核結(jié)果見(jiàn)表1～4。

經(jīng)復(fù)核，4個(gè)批次鱟試劑最大濃度2λ的4支管均為陽(yáng)性，最小濃度0.25λ的4支管均為陰性，陰性對(duì)照管均為陰性，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，且4個(gè)批次鱟試劑λc計(jì)算結(jié)果均在2λ～0.25λ，可用標(biāo)示靈敏度0.5 Eu/mL（0.25 Eu/mL）為該批次鱟試劑的靈敏度。

2.4 干擾試驗(yàn)

2.4.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)：將供試品溶液按梯度稀釋最大至15倍的5個(gè)稀釋級(jí)的溶液，用標(biāo)示濃度為0.5 Eu/mL的鱟試劑按中國(guó)藥典2015年版四部1143鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作，每個(gè)濃度平行做4支管，另加2支陰性對(duì)照管和2支供試品陰性對(duì)照管，2個(gè)批次供試品結(jié)果相同。標(biāo)示靈敏度0.5 Eu/mL批號(hào)1504152和批號(hào)1608291的鱟試劑結(jié)果相同，見(jiàn)表5。

表5 標(biāo)示靈敏度0.5 Eu/mL批號(hào)1504152和批號(hào)1608291的鱟試劑結(jié)果

從表5可以看出，本次實(shí)驗(yàn)有效，但是該供試品在稀釋到15倍時(shí)，對(duì)含1λ內(nèi)毒素的鱟試劑有干擾導(dǎo)致結(jié)果為陰性，按藥典規(guī)定，此時(shí)可通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋來(lái)排除干擾，我們只有將其繼續(xù)往下稀釋?zhuān)藭r(shí)MVD改變，c和L不變，故λ應(yīng)為0.25 Eu/mL，改用標(biāo)示靈敏度為0.25 Eu/mL的鱟試劑，稀釋至最大為30倍的6個(gè)稀釋級(jí)繼續(xù)重復(fù)上述預(yù)干擾試驗(yàn)，標(biāo)示靈敏度為0.25 Eu/mL，批號(hào)1612091和批號(hào)1703151的鱟試劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，結(jié)果見(jiàn)表6。

稀釋到30倍時(shí)，陰性對(duì)照管所有平行管都為陰性，2λ管均為陽(yáng)性，0.25λ管均為陰性，試驗(yàn)有效，1λ管均為陽(yáng)性，干擾被排除。由此可以得出清開(kāi)靈注射液對(duì)內(nèi)毒素檢查法有干擾，稀釋30倍可去除干擾。

表1 標(biāo)示靈敏度0.5 Eu/mL，批號(hào)1504152

表2 標(biāo)示靈敏度0.5 Eu/mL，批號(hào)1608291

表3 標(biāo)示靈敏度為0.25Eu/mL，批號(hào)1612091

表4 標(biāo)示靈敏度0.25 Eu/mL，批號(hào)1703151

表6 標(biāo)示靈敏度為0.25 Eu/mL，批號(hào)1612091和批號(hào)1703151的鱟試劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 凝膠法干擾試驗(yàn)

表8 16080421批次與17011722批次供試品實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 干擾試驗(yàn)：按照中國(guó)藥典2015年版四部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項(xiàng)下干擾試驗(yàn)表1制備溶液A、B、C、D，試驗(yàn)方法和步驟按按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下[4]。其中供試品溶液為稀釋30倍的溶液。結(jié)果見(jiàn)表7。

上表A和D均為陰性；鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果符合要求；供試品30倍稀釋液實(shí)驗(yàn)結(jié)果復(fù)核靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)要求。供試品干擾試驗(yàn)通過(guò)。

2.5 家兔法檢測(cè)：選取6只健康并經(jīng)預(yù)測(cè)合格的家兔，按中國(guó)藥典2015年版一部1142熱原檢查法檢驗(yàn)，2批次供試品實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。本次實(shí)驗(yàn)2批次供試品熱原試驗(yàn)符合規(guī)定。

2.6 供試品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與家兔法檢測(cè)結(jié)果比較：本次實(shí)驗(yàn)2批次供試品稀釋30倍，參照2015年版藥典四部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，用0.25 Eu/支的鱟試劑檢驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。按照2015年版藥典四部1142熱原檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也均符合規(guī)定，兩種方法結(jié)果完全一致。

3 討 論

清開(kāi)靈注射液為中成藥制劑，為臨床常用藥品，目前仍采用家兔法檢測(cè)熱原，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且成本高。大家都在檢討對(duì)它改成進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，但是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)考慮到藥品本身對(duì)試劑的干擾，經(jīng)論證，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用0.25 Eu/mL的鱟試劑檢驗(yàn)的采用供試品30倍稀釋液對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)以去除干擾。