李金誠(chéng)，燕夢(mèng)云，王松月，周文斌，裴凌鵬

(民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中央民族大學(xué)，北京 100081)

骨質(zhì)疏松癥是一種因骨組織代謝異常引發(fā)的疾病，已成為嚴(yán)重威脅中老年人健康和生活質(zhì)量的高發(fā)病，其病因主要是由于骨形成與骨吸收之間動(dòng)態(tài)性失衡所導(dǎo)致。成骨細(xì)胞作為骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，其增殖、分化缺陷是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的根本原因之一[1]。刺老苞根皮為五加科植物棘莖楤木(AraliaechinocaulisHand.-Mazz.)的根皮，藥材呈塊片狀或槽狀，氣微香，嚼之帶有黏液性?！兜崮媳静荨吩唬骸按棠X包，又名刺老苞、鵲不宿。味苦辛、性涼。入脾、腎二經(jīng)。治風(fēng)濕疼、胃疼、跌打損傷。骨折，用鮮根搗碎，酒炒熱敷。[2]”前期研究表明，刺老苞根皮總水提物可通過下調(diào)成骨細(xì)胞 Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Axin蛋白表達(dá)，延長(zhǎng)成骨細(xì)胞S期，促進(jìn)其增殖、分化及礦化功能的作用[3-4]。為詮釋刺老苞根皮不同提取方式中其他活性成分，本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察刺老苞根皮醇提物對(duì)原代成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化的影響，為下一步分離純化相關(guān)活性成分化合物提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

細(xì)胞超凈操作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 美國(guó))；L535R-1低速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；MultiSkan酶標(biāo)儀(Thermo Scientific 美國(guó))；熒光倒置顯微鏡(Olympus 日本)；大孔吸附樹脂(MCI)柱(三菱公司，日本)；刺老苞根皮(湖北恩施中藥材有限公司，批號(hào) 0P 091101，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系楊瑤珺教授鑒定)；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶溶液(Gibco 美國(guó))；青霉素/鏈霉素(P/S)、II型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅S染液、二甲基亞砜(Sigma 美國(guó))；PBS(北京昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒、堿性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物制品有限公司)。

1.2 動(dòng)物

新生24 h SD大鼠乳鼠(雄性)10只，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK-(軍)2012-0004)。

2 方法

2.1 刺老苞根皮醇提物制備

取刺老苞根皮2 kg，經(jīng)70%乙醇加熱回流提取3次，2 h/次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮為400 mL浸膏；加入200 mL 10%乙醇溶液稀釋；過MCI-GEL大孔吸附樹脂柱，30%、50%乙醇梯度洗脫、分離；收集洗脫液，低溫真空干燥成粉末，共獲得4種不同刺老苞根皮醇提物30%(1-3)：5.23 g、30%～50%(3-4)：23.17 g、50%(1)：13.72 g、50%(2-3)：4.29 g。

2.2 原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)

取雄性SD乳鼠10只，用75%乙醇浸洗后，在超凈操作臺(tái)內(nèi)解剖取出顱蓋骨，去除其他組織，PBS清洗，加入3 mL消化液(0.25%胰蛋白酶液:II型膠原酶溶液=2∶1)，37 ℃消化5 min棄上清液；加入3 mL 消化液，37 ℃消化10 min，收集上清液，加9 mL完全培養(yǎng)基(89%α-MEM、10% FBS、1% P/S)中和消化，重復(fù)消化4次，收集液體離心吸去上清液，加完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。

2.3 成骨細(xì)胞鑒定

取第3代前成骨細(xì)胞，以1×105cells/mL接種于24孔培養(yǎng)板，1 mL/孔；培養(yǎng)48 h后加分化培養(yǎng)基(含10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL 抗壞血酸)誘導(dǎo)，每2 d換液1次，培養(yǎng)4 d和14 d，分別進(jìn)行ALP染色和礦化結(jié)節(jié)染色鑒定。

2.4 成骨細(xì)胞毒性分析

取第4代前成骨細(xì)胞，以2.5×104cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板，0.2 mL/孔；培養(yǎng)48 h后加含藥培養(yǎng)基干預(yù)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)分組為不含藥物的對(duì)照組和刺老苞根皮醇提物處理組，另設(shè)調(diào)零孔，每組3個(gè)復(fù)孔；48 h后吸去培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞2次，按MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)測(cè)試盒說明檢測(cè)，即加0.09 mL新鮮培養(yǎng)液和0.01 mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h取出吸去上清，加0.11 mL Formazan溶解液，低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其490 nm處各孔吸光值(A)。

2.5 ALP活性測(cè)定

取第4代前成骨細(xì)胞，以1×105cells/mL接種于24孔培養(yǎng)板，1 mL/孔；培養(yǎng)48 h后，加含藥(1、10、100 μg/mL)分化培養(yǎng)基(含10% FBS、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸)干預(yù)，每2 d換液1次，4 d后吸取培養(yǎng)液離心，收集上清液按堿性磷酸酶測(cè)試盒說明測(cè)定。

2.6 成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)染色

取第4代前成骨細(xì)胞，以1×105cells/mL接種于24孔培養(yǎng)板，1 mL/孔；培養(yǎng)48 h后加含藥(1、10、100 μg/mL)分化培養(yǎng)基(含10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL 抗壞血酸)干預(yù)，每2 d換液1次，14 d后吸去培養(yǎng)液，各孔用PBS清洗3次；加10%中性福爾馬林，2 mL/孔，固定15 min，蒸餾水沖洗3次，按茜素紅S染色試劑說明操作。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 原代成骨細(xì)胞鑒定

圖1～3顯示，第3代前成骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，可見不規(guī)則伸展?fàn)钯N壁細(xì)胞，48 h后細(xì)胞呈三角形、長(zhǎng)梭形等形態(tài)，細(xì)胞核清晰可見。分化誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d后經(jīng)ALP染色，熒光倒置顯微鏡下可見灰黑色顆粒或塊狀、條狀沉淀；分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，經(jīng)茜素紅染色，熒光倒置顯微鏡下可見橙紅色鈣沉積物。

3.2 刺老苞根皮醇提物對(duì)前成骨細(xì)胞活性的影響

表1顯示，與對(duì)照組比較，刺老苞根皮醇提物30%(1～3)、50%(1)、50%(2`3)不同濃度組(100、200、400、800 μg/mL)干預(yù)前成骨細(xì)胞48 h后，各濃度組細(xì)胞生存率增高，均能明顯促進(jìn)前成骨細(xì)胞的增殖；刺老苞根皮醇提物30%～50%(3～4)100 μg/mL濃度組細(xì)胞生存率增高，200、400、800 μg/mL濃度組細(xì)胞生存率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。4種刺老苞根皮醇提物濃度在0～100 μg/mL，可排除刺老苞根皮醇提物促進(jìn)前成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的假陽(yáng)性結(jié)果。

3.3 刺老苞根皮醇提物對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響

表2顯示，與對(duì)照組比較，4種刺老苞根皮醇提物各濃度組干預(yù)成骨細(xì)胞4 d后，刺老苞根皮醇提物30%(1～3)、50%(1)、50%(2～3)低濃度組(1 μg/mL)細(xì)胞ALP活性明顯提高，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；中、高濃度組(10、100 μg/mL)細(xì)胞ALP活性下降，對(duì)成骨細(xì)胞分化呈抑制作用。

圖1 成骨形態(tài)

圖2 ALP染色

圖3 礦化染色

組 別例數(shù)Cell Viability(%)30%(1～3)30%～50%(3～4)50%(1)50%(2～3)Control3100100100100100 μg/mL3111.82±10.06129.21±14.62**132.60±7.74**203.28±9.85**200 μg/mL3122.66±4.1165.31±7.00**113.57±0.66166.30±4.66**400 μg/mL3112.32±13.4845.84±2.88**94.31±11.82184.03±3.96**800 μg/mL3134.25±25.15*52.33±12.35**137.20±20.21**172.87±6.21**

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

表2 4種刺老苞根皮醇提物對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05

3.4 刺老苞根皮醇提物對(duì)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的影響

表3顯示，與對(duì)照組比較，4種刺老苞根皮醇提物各濃度組干預(yù)成骨細(xì)胞14 d后，鈣化結(jié)節(jié)面積占比增加，形狀多為圓形和橢圓形，少數(shù)為不規(guī)則形狀，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 4種刺老苞根皮醇提物對(duì)成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

4 討論

成骨細(xì)胞是由間充質(zhì)祖細(xì)胞(即軟骨祖細(xì)胞)分化產(chǎn)生，是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，其胞漿膜上分泌的ALP (同型二聚體糖蛋白)是成骨細(xì)胞早期分化的指標(biāo)。ALP調(diào)節(jié)骨基質(zhì)的成熟穩(wěn)定，是礦化的先決條件，而礦化是成骨細(xì)胞分化的最后階段，也是成骨細(xì)胞體外成骨的早期標(biāo)志。當(dāng)成骨細(xì)胞數(shù)量不足或活性功能低下時(shí)，將打破骨形成與骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡，加速骨質(zhì)疏松癥的形成[5-7]。

刺老苞根皮作為土家族臨床常用藥，對(duì)骨損傷具有很好的療效。臨床數(shù)據(jù)表明，刺老苞根皮具有修復(fù)骨損傷的功能。如烏日?qǐng)D等[8]發(fā)現(xiàn)，刺老苞根皮能減輕膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者局部癥狀，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能。前期研究發(fā)現(xiàn)，刺老苞根皮含有較高的總皂苷、總黃酮和多糖，其總水提物有促進(jìn)骨形成、提高骨礦物質(zhì)水平與骨密度值的作用，其黃酮類成分對(duì)絕經(jīng)后所致骨質(zhì)疏松引起的骨折具有一定的防治作用[9-10]，但關(guān)于刺老苞根皮皂苷成分及其藥效學(xué)研究尚未有突破性進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)采取70%乙醇回流，10%乙醇稀釋過柱，30%、50%乙醇梯度洗脫，獲得4種主要成分為皂苷的刺老苞根皮醇提取物，并用于原代成骨細(xì)胞干預(yù)研究，分析不同濃度乙醇提取的皂苷成分對(duì)原代成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響，而對(duì)于破骨細(xì)胞方面的研究則另文報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原代成骨細(xì)胞經(jīng)刺老苞根皮醇提物不同濃度組干預(yù)后，細(xì)胞生存率明顯高于對(duì)照組，低濃度組ALP活性升高，礦化結(jié)節(jié)面積增加。分析原因可能為低濃度的刺老苞根皮醇提物可以通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加對(duì)ALP的需求量，致使ALP活性提高，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，提高骨基質(zhì)礦化的作用效率，促進(jìn)骨形成。

綜上所述，4種刺老苞根皮醇提物可促進(jìn)原代成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化，其研究結(jié)果可以為全面評(píng)價(jià)刺老苞根皮臨床防治骨質(zhì)疏松癥的藥效作用提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)，但因刺老苞根皮皂苷成分研究起步較晚，目前研究?jī)?nèi)容主要圍繞藥物物質(zhì)基礎(chǔ)方面開展，其藥效藥理機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探討。