唐俊妮，羅雙華，劉 驥，趙燕英，陳 娟，湯 承

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一種常見的食源性和醫(yī)源性致病菌，能夠分泌多種毒素，如腸毒素/類腸毒素（staphylococcal enterotoxins/staphylococcal enterotoxins-like，SEs/SEls）、剝脫毒素和中毒性休克毒素（toxic shock syndrome toxin，簡寫為TSST-1，原命名腸毒素 SEF）等.其中，SEs/SEls的分泌是金黃色葡萄球菌引起食物中毒的主要原因[1-2].SEs/SEls是一類結構相似，具有超抗原（superantigen，SAg）活性的細菌毒素，在極低劑量（ng或pg）時即可刺激T細胞，在T細胞抗原受體上進行增殖，并能明顯增強T細胞活性[3-4].SEs/SEls根據(jù)發(fā)現(xiàn)的基因型及先后順序目前分為24種，包括傳統(tǒng)腸毒素SEA-SEE、新型腸毒素 SEG-SEJ、類腸毒素 SElKSElY等[2].SEs/SEls也可作為超抗原，具有開發(fā)成為抗腫瘤藥物的潛在可能[5-6].因天然SEs/SEls產(chǎn)量低，從產(chǎn)毒培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌上清液中分離純化SEs/SEls比較困難[7-8].因此，關于上述多數(shù)SEs/SEls的活性及功能研究受到限制，大多數(shù)新型腸毒素或類腸毒素（SEs/SEls）的致病性及其引起的免疫耐受性等相關作用機制尚不清楚.

葡萄球菌腸毒素P（簡稱SEP），是新型腸毒素的一種，其分子量約為27.89 kD，具有刺激T細胞增殖及催吐特性的超抗原毒素[9].研究還認為SEP可能與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株引起的菌血癥相關聯(lián)[10].如果要對SEP進行深入的結構和功能研究，還需純化蛋白作為基礎.但目前國內外關于SEP蛋白相關報道比較少[9-10].

因此，本研究擬進行sep基因的克隆和重組質粒pET-30a-SEP的構建，在此基礎上，進行重組蛋白原核表達條件優(yōu)化與重組蛋白的純化，為后續(xù)深入研究SEP的結構與功能奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要設備

菌株和質粒:表達宿主大腸桿菌（E.coli）菌株DH5α、BL 21（DE 3）、BL 21（DE3）pLySs、Rosetta（DE3）、pMD18-T質粒、原核表達質粒 pET-30a均購自天根生化科技（北京）有限公司.

主要試劑:卡那霉素、氯霉素、IPTG 購自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、咪唑購自Amresco公司；SDS-PAGE上樣緩沖液購自康為世紀生物科技有限公司；Ni2＋-NTA-Sepharose 購自 GE Healthcar公司；Millipore 10 KD超濾管購自Millipore公司；PCR擴增試劑、核酸分子量標準、限制性內切酶NdeI和XhoI購自寶生物工程（大連）公司.

主要儀器設備:HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱江蘇省太倉市實驗設備廠；GHP-9080水式恒溫培養(yǎng)箱上海齊欣科學儀器有限公司；MLS-3020電熱自動滅菌鍋日本SANYO公司；5804R冷凍離心機Eppendorf公司；SC-15數(shù)控超級恒溫槽、JY92-IIN超聲破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫金屬浴、UV-6100分光光度計上海美普達儀器有限公司；伯樂Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀伯樂科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 基因sep的克隆與表達載體構建

金黃色葡萄球菌基因組DNA采用微波加熱法提取[11].根據(jù)GenBank中報道的金黃色葡萄球菌sep基因序列（NC＿004740），采用 Premier 6.0軟件進行引物設計，基因 sep克隆引物上游序列（P1）:5′-CGTACGCATATGAGTAAAATAAAAAAAACAACA（下劃線為NdeI酶切位點，ATG為起始密碼子）；下游序列（P2） :5′-CGCTAGCTCGAGTCAAGTTGTATATAAATATATATCAA（下劃線為XhoI酶切位點）；引物由生工生物公司（上海）合成.

PCR 擴增條件:PCR buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 3 μL，Mg2＋（25 mmol/L） 4 μL，上下游引物P1和P2等量混合物 （濃度為10 μmol/L）3 μL，金黃色葡萄球菌基因組DNA模板1μL，Pfu DNA Polymerase 1μL，ddH2O 33 μL，反應體系共計50 μL.PCR反應條件為:95 ℃ 4 min；94 ℃，40 s；65 ℃ 50 s；72 ℃60 s，35個循環(huán)；72℃，8 min.擴增所得片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測及PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與質粒載體pMD18-T進行T-A連接，分別將插入sep基因的pMD18-T質粒與空載質粒pET-30a用NdeI/XhoI雙酶切，將上述雙酶切獲得的純化片段用T4 DNA連接酶連接，使得目的基因定向克隆至表達載體pET-30a中.將插入sep基因的陽性質粒命名為pET-30a-SEP，同時將質粒進行雙酶切驗證和送生工生物公司（上海）測序.

1.2.2 最佳表達宿主菌的確定

將酶切鑒定的重組質粒pET-30a-SEP分別轉入表達宿主大腸桿菌 BL 21（DE 3）、BL 21（DE3）pLySs和BL 21（Rosetta）中，分別涂布于含相應抗生素的平板上，其中，BL 21（DE 3）和 BL21（DE3）pLysS 涂布于含卡那霉素30 μg/mL的LB瓊脂上，BL 21（Rosetta）涂布于含氯霉素10 μg/mL的LB瓊脂上，設置對照，37℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，之后隨機挑取含重組質粒的單菌落于含相應抗生素的液體LB中，過夜培養(yǎng)，在設定條件下誘導表達，離心收集菌體，SDS-PAGE分析各表達宿主菌蛋白的表達情況.

1.2.3 重組蛋白不同表達條件優(yōu)化

選擇1.2.2中最優(yōu)表達菌株，分別確定最優(yōu)IPTG濃度（37 ℃誘導6 h，IPTG 濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L）、最佳誘導時間（37℃，最優(yōu) IPTG 濃度，分別誘導 0、2、4、6、8、10、12、24 h）、最佳誘導溫度（最優(yōu)IPTG濃度，最佳誘導時間，分別在37、27、17℃下誘導）和最佳 Zn2＋濃度（最佳誘導時間、溫度、IPTG濃度，設置Zn2＋濃度梯度為0、1、5、10、15、20、25 mmol/L）.SDS-PAGE 分析不同條件下蛋白的表達情況.

1.2.4 重組蛋白rSEP純化

用上述確定的最佳表達條件大量培養(yǎng)重組宿主菌（2 L的培養(yǎng)基），測菌液吸光度（A600nm）至0.6～0.7時，加入最佳濃度IPTG誘導劑誘導，之后離心收集菌體，重懸于Buffer A緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 8.0）中，冰浴超聲破碎（超聲3 s，間隔6 s，共30 min），在4℃，12000 rpm 條件下離心20 min收集上清，采用緩沖液平衡好的 Ni2＋-NTASEPharose親和層析柱中反復穿透上清液1 h，隨后用洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，20～200 mmol/L咪唑，pH 8.0）梯度洗脫，收集目的蛋白，采用SDS-PAGE檢測純化的目的蛋白.

2 結果與分析

2.1 基因sep的PCR擴增及重組表達載體的構建結果

以篩選攜帶sep基因的金黃色葡萄球菌DNA為模板進行PCR擴增，sep基因擴增的PCR條帶見圖1（A），凝膠電泳表明 PCR擴增的目的基因片段大小與預期理論大小相符合，證明擴增得到了預期的sep基因片段.進一步對該片段進行克隆和測序鑒定，表明序列正確.通過酶切轉化篩選，獲得陽性克隆子.進一步對構建的重組表達載體pET-30a-SEP進行雙酶切驗證，得到了兩條與預期大小吻合的酶切產(chǎn)物片段，見圖1（B）.至此，表明重組表達質粒載體 pET-30a-SEP構建成功.

圖1 sep基因的PCR擴增電泳圖（A）和表達載體pET-30a-SEP雙酶切電泳圖（B）Fig.1 The results for sep gene PCR amplification and pET-30a-SEP expression vector construction

2.2 原核表達體系不同表達條件的優(yōu)化結果

針對表達宿主菌的優(yōu)化，如圖2所示，圖2A中的表達宿主菌BL 21（DE3）pLySs菌株中融合蛋白表達量明顯高于 BL 21（Rosetta）（圖 2B）和 BL 21（DE 3）（圖2C）中融合蛋白的表達量.因此，后續(xù)實驗選取BL 21（DE3）pLySs為最佳表達宿主菌株.

針對表達時間的優(yōu)化，如圖3（A）所示，誘導時間為8 h時融合蛋白表達量高（3A中的泳道6）；針對IPTG的優(yōu)化濃度，如圖3（B）所示，IPTG濃度為0.2 mmol/L時融合蛋白表達量高（3B中的泳道2）；針對溫度和Zn2＋濃度優(yōu)化條件，如圖3（C）和3（D）所示，結果表明37℃和Zn2＋濃度為1 mmol/L時融合蛋白表達量高（3C中的泳道2，3D中的泳道2），從而優(yōu)化得到重組質粒的最佳表達條件.

進一步在最優(yōu)表達條件（37℃，0.2 mmol/L IPTG，1 mmol/L Zn2＋濃度，誘導 8 h）下，對 BL 21（DE3）pLySs宿主菌的單克隆進行小量誘導和表達驗證，如圖4所示，多次平行試驗均獲得了rSEP的高效可溶性表達（圖4）.證實優(yōu)化得到的最佳表達條件成功（表達宿主菌選擇BL 21（DE3）pLysS、最佳IPTG濃度為0.2 mmol/L、最佳誘導時間為8 h、最佳表達溫度為37℃、最佳添加的Zn2＋濃度為1 mmol/L）.

圖2 pET-30a-SEP質粒在不同大腸桿菌表達宿主中目的蛋白的SDS-PAGE圖Fig.2 The protein expression of pET-30a-SEP in differentE.coli expression host bacteriaA 表達宿主菌為 BL 21（DE3）pLySs；B 表達宿主菌為 BL 21（Rosetta）；C 表達宿主菌為 BL 21（DE3）；M為蛋白分子量標準，泳道1為未誘導；泳道2-7為6個隨機挑取的表達菌株在IPTG誘導下的表達

圖3 不同表達條件的優(yōu)化結果Fig.3 The optimization results of pET-30a-SEP protein expression conditions

圖4 rSEP重組蛋白在最優(yōu)條件下表達的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE analysis for the optimal expression conditions of rSEP proteinM為蛋白分子量標準；泳道1為未誘導；泳道2～7為最優(yōu)條件下6個隨機挑取的菌株表達的目的蛋白

2.3 重組蛋白rSEP的純化結果

按上述最優(yōu)條件進行擴大培養(yǎng)，經(jīng)過超聲波破碎，粗提液進行鎳親和層析純化，分別用含20、50和200 mM咪唑的緩沖液梯度洗脫雜蛋白，并進行SDSPAGE分析，結果見圖5.由圖5（A）的第7泳道可見，重組蛋白rSEP采用200 mM咪唑緩沖液洗脫效果最好.進一步驗證純化條件，結果見圖5（B），表明獲得純度較高的rSEP蛋白，通過蛋白定量試劑盒測定純化的rSEP蛋白濃度為1.8 mg/mL，可滿足后續(xù)研究.

圖5 純化重組蛋白rSEP的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis for the rSEP fusion protein purification

3 討論

金黃色葡萄球菌是引起食物中毒的重要致病菌之一，而腸毒素的產(chǎn)生是導致食物中毒的主要原因[12].金黃色葡萄球菌腸毒素基因種類繁多，sep基因作為眾多腸毒素基因的一種，在臨床上不斷被檢出，如Hait等[13]在引起食物中毒事件的面包店中檢測出sep基因；Liu等[14]從河南省2013～2014年收集的健康動物和醫(yī)院病人樣本中檢出sep基因，發(fā)現(xiàn)其攜帶率為14.69%；Wu等[15]從零售蔬菜分離的金黃色葡萄球菌中檢出sep基因，攜帶率高達70.0%.這些研究說明sep基因在金黃色葡萄球菌中普遍流行，該基因表達的SEP蛋白也可能具有潛在的食品安全威脅.但目前關于SEP蛋白的致病機制和功能研究報道不多，面臨的主要困難是天然SEP蛋白產(chǎn)量低，從產(chǎn)毒培養(yǎng)液中分離純化困難，如果需要制備SEP蛋白純品，需對sep基因編碼蛋白進行克隆表達與純化.因此，本研究中，我們根據(jù)GenBank中報道的金黃色葡萄球菌sep基因序列（NC＿004740）設計引物，又從我們實驗室保存的臨床分離金黃色葡萄球菌菌株中篩選獲得sep基因序列，為成功構建重組表達載體 pET-30a-SEP奠定了基礎.

在表達條件的優(yōu)化實驗中，我們首先對經(jīng)典的大腸桿菌表達宿主菌 BL 21（DE 3）、BL 21（DE3）pLySs、BL 21（Rosetta）進行原核表達系統(tǒng)的優(yōu)化，實驗發(fā)現(xiàn)表達宿主 BL 21（DE3）pLySs效果更佳，BL21（DE3）PlySs是在BL21（DE3）基礎上，附帶了T7溶菌酶基因，可更嚴謹控制T7聚合酶的表達.因此，在后續(xù)的蛋白表達中，選擇BL 21（DE3）pLySs作為rSEP融合蛋白的表達宿主菌.在此基礎上，本研究進一步對誘導時間、IPTG濃度、溫度、以及Zn2＋濃度進行優(yōu)化，最終獲得rSEP融合蛋白的最優(yōu)表達條件.通過多次驗證，均實現(xiàn)了對融合蛋白rSEP的高效可溶性表達.在對表達蛋白純化的研究中，本研究采用 Ni2＋-NTASEPharose親和層析柱反復穿透上清液，并對洗脫緩沖液中咪唑濃度進行優(yōu)化探索，針對rSEP融合蛋白，采用200 mM的咪唑洗脫效果更好，最終獲得了純度較高的rSEP蛋白，實現(xiàn)了本研究的目的.

至此，本研究成功構建了金黃色葡萄球菌SEP腸毒素的重組表達載體pET-30a-SEP，對rSEP蛋白進行表達和純化，并獲得了純度較高的rSEP蛋白，為后續(xù)制備單抗、診斷試劑及SEP致病機制研究奠定了基礎.同時，本研究的優(yōu)化條件也可為其他葡萄球菌腸毒素蛋白的表達與純化提供借鑒.