曹霞飛 何華紅 吳 婷 李志芳

1.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511405；2.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州 510160

濕潤燒傷膏是一種用于各種燒、燙、灼傷的局部給藥制劑，起到清熱解毒、止痛、生機的作用，其組分中含有黃連、黃柏、黃芩等多種中藥成分[1-3]。《中國藥典》明確規(guī)定，用于手術、燒傷及嚴重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查法規(guī)定[4-6]，且應嚴格控制其中的內(nèi)毒素含量。目前《中國藥典》尚未收載該品種的內(nèi)毒素檢查法。本文對該供試品細菌內(nèi)毒素檢查方法進行探討，建立可行性方法，為該品種質(zhì)量標準的完善和提高提供實驗依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

MS-1型自動漩渦震蕩器（德國IKA）；TW12型六孔水浴箱（日本Julabo）；LK164-03型內(nèi)毒素定量儀（美國Lab Kinetice Ltd.）；XS204型分析天平（美國 Mettler Toledo.）。

1.2 試劑

濕潤燒傷膏：批號20140704，汕頭美寶制藥有限公司。鱟試劑（TAL）：批號1309222，湛江安度斯生物有限公司；批號13030612，福州新北生化工業(yè)有限公司；細菌內(nèi)毒素標準品：中國藥品生物制品檢定所，批號150601-201377，規(guī)格70EU/mL；細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：湛江安度斯生物有限公司，批號1303290，規(guī)格50mL/支。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗[6-7]

按照2015年版《中國藥典》（四部）通則細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核。取細菌內(nèi)毒素工作標準品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按細菌內(nèi)毒素工作標準品的使用說明書，用移液管加入1mL的細菌內(nèi)毒素檢查用水，溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴。置自動漩渦混合器上混合30min，即為70EU/mL內(nèi)毒素標準溶液。然后再稀釋制成 0.5、0.25、0.125和 0.06EU/mL 四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30s。具體的稀釋過程如下：取0.4mL內(nèi)毒素標準溶液加上3.6mL BET水即為1∶10稀釋液，得到7EU/mL內(nèi)毒素標準溶液。取1mL的1∶10稀釋液，加上6mL BET水即為1∶70稀釋液，得到1EU/mL內(nèi)毒素標準溶液。取4mL的1∶70稀釋液，加上4mL BET水即為1：140稀釋液，得到0.5EU/mL內(nèi)毒素標準溶液。取5mL的1∶140稀釋液，加上5mL BET水即為1：280稀釋液，得到0.25EU/mL內(nèi)毒素標準溶液。取6mL的1∶280稀釋液，加上6mL BET水即為1∶560稀釋液，得到0.125EU/mL內(nèi)毒素標準溶液。取2mL的1∶560稀釋液，加上2mL BET水即為1∶1120稀釋液，得到0.06EU/mL內(nèi)毒素標準溶液。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

取靈敏度標示值λ=0.25EU/mL的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)，加入0.1mL BET水復溶，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。將已充分溶解的待復鱟試劑18支放在試管架上，其中16管分別加入0.5、0.25、0.125EU/mL和0.06EU/mL四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，2支加入BET水作為陰性對照。內(nèi)毒素標準溶液和BET水的加樣量均為0.1mL/支。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入（37±1）℃的恒溫器中，保溫（60±2）min。見表1。

3批鱟試劑復核結果λc均在0.5λ-2λ范圍，均可用于細菌內(nèi)毒素檢測。

2.2 內(nèi)毒素限值（L）確定

中國藥典2015版四部通則的細菌素檢查法關于內(nèi)毒素限值的確定：濕潤燒傷膏臨床使用為外用。涂于燒、燙、灼傷等創(chuàng)面（厚度薄于1mm），每4～ 6h更換新藥。燒傷膏的密度[8]ρ≈1.0g/mL，按人體表面為1.6m2，假設極端情況患者全身涂滿厚度為1mm的濕潤燒傷膏，計算得到體積：

為了保證濕潤燒傷膏用藥安全，根據(jù)藥典中注射劑K=5EU/mL，濕潤燒傷膏的K值參考最嚴格的注射劑限制，即取濕潤燒傷膏K=5EU/mL。則：

按1g濕潤燒傷膏與2mL正己烷的比例溶解，再用細菌內(nèi)毒素檢查用水（與正己烷按1∶1比例）充分振蕩混勻，萃取水相，故其水相的細菌內(nèi)毒素限值相當于：

2.3 燒傷膏萃取液中細菌內(nèi)毒素回收率試驗[9-11]

2.3.1 標準曲線溶液的制備 取細菌內(nèi)毒素工作標準品1支，加入細菌內(nèi)毒素檢查用水1mL，制成70EU/mL的溶液，密封后，置自動漩渦混合器上振蕩30min后取下，用細菌內(nèi)毒素工作標準品溶液，制成 10EU/mL、1.0EU/mL、0.1EU/mL 3 個濃度的稀釋液，每一濃度做3支平行管。同時用BET水與鱟試劑反應作為陰性對照。

2.3.2 供試品溶液的制備 取濕潤燒傷膏2.25g，加入4.5mL正己烷，放入自動漩渦混合器上振蕩（頻率2000r/min，時間2min），再加入4.5mL細菌內(nèi)毒素檢查用水繼續(xù)萃取。靜止使之分層后，取萃取液到另一支試管中備用，即樣品空白溶液C0。

將細菌內(nèi)毒素標準品復溶（規(guī)格：70EU/mL），加入內(nèi)毒素檢查用水，分別稀釋制成45EU/mL、9EU/mL的待接種液。取一定量的燒傷膏，經(jīng)正己烷萃取后，按一定比例分別加入接種液，以上每一步驟均需混勻，再以2000r/min，繼續(xù)萃取2min，制得終溶度為1.0、0.5、0.3EU/mL供試品溶液，靜止使之分層后，取萃取液標記為 C1.0、C0.5、C0.3。

2.3.3 標準曲線的可靠性驗證 根據(jù)《中國藥典》細菌內(nèi)毒素動態(tài)顯色法的規(guī)定，陰性對照的反應時間＞3600S，且大于標準曲線最低濃度反應時間（749.67S），變異系數(shù)（CV）≤10%。將全部數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，得回歸方程為：LgTg=2.7676-0.1064LgC。相關系數(shù)R=-0.9997，∣R∣＞ 0.980，見表2。標準曲線成立，試驗有效。

表2 動態(tài)顯色法標準曲線的可靠性試驗結果（n=3）

2.3.4 不同接種濃度供試品的回收率比較 為證明樣品中所含內(nèi)毒素能否完全被萃取至待檢測水溶液中，接種一定量的內(nèi)毒素標準品[12]，使外加內(nèi)毒素標準的終濃度為1.0、0.5及0.3EU/mL，通過動態(tài)顯色法，分別對其進行回收率試驗驗證，看其回收率是否在50%～200%范圍內(nèi)。分別向上述各管中加入動態(tài)濁度法鱟試劑0.1mL，每個濃度設2孔，另取2孔加入0.1mL細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。振蕩混勻后放入動態(tài)試管檢測儀，于(37±1)℃，波長405nm處測定各濃度的反應時間，并自動計算出供試品的內(nèi)毒素含量及回收率。見表3。

表3 動態(tài)顯色法測定結果（n=2）

按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量ct和cs，該試驗條件下的回收率（R）計算見式：

樣 品 C1.0的 回 收 率=（2.6311-0.0020）/1.0=262.91%；樣品C0.5的回收率=（0.0142-0.0020）/0.5=2.44%；樣品C0.3的回收率=（0.1590-0.0020）/0.3=52.3%；樣品C0.3的回收率細菌內(nèi)毒素的回收率為52.3%，在50%～200%之間。

2.4 水相萃取液凝膠法干擾試驗

2.4.1 有效稀釋倍數(shù) 濕潤燒傷膏經(jīng)萃取后的水相溶液的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：是指在試驗中濕潤燒傷膏經(jīng)萃取后的水相溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。MVD=cL/λ（L為供試品的內(nèi)毒素限值；c為濕潤燒傷膏萃取液濃度，當L以EU/mL表示時，則c等于1.0ml/mL；λ為在鱟試劑的標示靈敏度。）試驗用鱟試劑靈敏度λ在0.25～0.03EU/mL。則萃取液對應的有效稀倍數(shù)計算見式：

MVD0.25=0.375/0.25=1.5倍；MVD0.125=0.375/0.125=3倍；MVD0.06=0.375/0.06=6倍；MVD0.03=0.375/0.03=12倍。

2.4.2 干擾預試驗 將濕潤燒傷膏萃取液用細菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋1.5、3、6、12倍，將此系列濃度的溶液記為NPC。

同時在上述溶液中加入細菌內(nèi)毒素標準溶液，使每一濃度的試驗液中均含有2λ（即0.5EU/mL）濃度的細菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.25EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑，分別將NPC和PPC進行反應，每一濃度重復兩管。并設陽性和陰性對照。見表4。

表4 水相萃取溶液的干擾預試驗結果

由以上水相萃取溶液的干擾試驗預試驗結果可以初步了解：湛江安度斯生物有限公司對水相萃取液的細菌內(nèi)毒素的試驗結果均無干擾；福州新北生化工業(yè)有限公司對水相萃取液的細菌內(nèi)毒素的試驗結果在進行6倍及以下稀釋濃度無干擾。

2.4.3 水相萃取溶液的凝膠法正式干擾試驗 為了最終確定濕潤燒傷膏經(jīng)萃取后的水相溶液是否存在干擾因素的影響，再進行正式干擾試驗。用靈敏度為0.25EU/mL，兩個不同廠家的鱟試劑按中國藥典2015年版四部通則的細菌內(nèi)毒素檢查法進行試驗，取萃取液（6倍稀釋），用BET水和供試品稀釋液將對應的細菌內(nèi)毒素工作標準品稀釋成2λ，λ，1/2λ和1/4λ濃度的PPC系列和供試品稀釋液NPC系列，每一稀釋濃度平行4管，同時用上述供試品稀釋液和BET水各做兩管陰性對照管，按公式計算BET水和供試品稀釋液反應終點濃度的幾何平均值（Es和 Et），Es=lg－ 1（Xs/4），Et=lg－1(Xt/4)，見表 5。

其中系列溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）計算見式：

式中Xs和Xt分別為系列溶液的反應終點濃度的對數(shù)值（lg），故：

正式干擾試驗結果表明：Es1 和Es2均在0.5λ ～ 2λ（包 括 0.5λ 和 2λ） 及 Et1在 0.5 Es1：2 Es1（包 括 0.5 Es1和 2 Es1）和 Et2在 0.5 Es2～2 Es2（包括0.5 Es2和2 Es2）范圍之內(nèi)，確認水相萃取溶液（6倍稀釋）無干擾影響。

3 討論

濕潤燒傷膏為脂溶性藥物[4]，由于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應一般都是在水溶液中進行[13]，而濕潤燒傷膏不溶于水，因此不能直接進行細菌內(nèi)毒素檢查。國外實驗室已進行過前期研究證明，正己烷是油脂類合適的溶劑[14]。利用細菌內(nèi)毒素可溶于水的特性，對濕潤燒傷膏，先用正己烷溶解后，再與細菌內(nèi)毒素檢查用水充分振蕩混勻，取水相萃取液進行細菌內(nèi)毒素檢查。對此方法我們重點考察了兩方面：首先，考察樣品處理過程中內(nèi)毒素的回收率，否則對水相溶液進行內(nèi)毒素檢查不能準確反映樣品中的內(nèi)毒素含量。且考慮不同濃度的內(nèi)毒素在油相和水相溶液中的分配比例可能不同，其回收率存在差異，因此采用濁度法對外接種內(nèi)毒素多種濃度進行回收率試驗比較。本研究在國外實驗室研究[15]的基礎上確證了燒傷膏水相萃取液稀釋6倍及以下濃度無干擾；外加接種0.3EU/mL內(nèi)毒素回收率為52.3%，符合中國藥典動態(tài)濁度法回收率50%～200%范圍內(nèi)。另兩個接種濃度（1.0及0.5EU/mL內(nèi)毒素）的回收率分別為262.89%及2.4%，結果不太理想，原因需做進一步探究。其次，盡管脂溶性藥物中的藥物和輔料均難溶于水，但萃取后的水相溶液可能含有藥物和輔料，應驗證萃取后水相溶液對鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應有無干擾作用，這便是我們進行干擾試驗的目的。實驗結果驗證了6倍稀釋濃度的水相萃取液對兩個廠家生產(chǎn)的鱟試劑均無干擾作用，Es/Et均在0.5～2.0范圍之內(nèi)。

綜上所述，濕潤燒傷膏可以使用細菌內(nèi)毒素檢查法進行檢測，本研究推薦使用動態(tài)濁度法鱟試劑對供試品的6倍稀釋液作內(nèi)毒素檢測，供試品對試驗無干擾。為下一步制定燒傷膏的細菌內(nèi)素檢查方法提供了有力證據(jù)。