李媛媛，賀石麟，白崇智，倪 艷，郝旭亮

（山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原030012）

通關(guān)藤，又名通光藤、烏骨藤等，為蘿摩科植物通關(guān)藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤莖，味苦，微寒，歸肺經(jīng)，具有止咳平喘、祛痰、通乳、清熱解毒之功效［1］。通關(guān)藤含有多種化學(xué)成分，包括C21甾體皂苷、三萜皂苷、多糖、醇類、揮發(fā)油、生物堿、有機酸等［2］。以通關(guān)藤單方水提取物制成的消癌平制劑，臨床應(yīng)用廣泛，常用于各種消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌、肝癌等的治療，還可用于放療、化療的輔助治療［3］。課題組前期研究表明通關(guān)藤多糖通過調(diào)整T細(xì)胞亞群分布異常而增強免疫低下小鼠的免疫功能［4］。已有研究表明C21甾體皂苷為通關(guān)藤主要抗腫瘤成分［5-7］，關(guān)于此類成分的提取純化工藝研究未見報道。目前大孔樹脂因其選擇性好、吸附迅速、綠色環(huán)保等優(yōu)勢，常應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取純化［8］。本研究擬采用大孔樹脂對通關(guān)藤甾體皂苷進(jìn)行提取純化工藝研究，通過測定其對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，確證甾體皂苷為其抗腫瘤的活性成分，為通關(guān)藤藥物進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與試劑

通關(guān)藤藥材，購于安國市藥興藥材有限公司，經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院李先榮主任藥師鑒定為蘿藦科植物通關(guān)藤的干燥藤莖；通關(guān)藤苷A實驗室自制，純度＞98%；香草醛、高氯酸、冰醋酸等化學(xué)試劑均為分析純。

人肝癌細(xì)胞株Hepg2由山西醫(yī)科大學(xué)惠贈。PBS、DMEM（高糖型）培養(yǎng)基購自Neuronbc公司；4%多聚甲醛固定液：博士德生物工程有限公司；青鏈霉素混合液、胰酶消化液、MTT、DMSO均購自Solarbio公司；特級胎牛血清購自北京元亨生物制品科技責(zé)任有限公司；順鉑注射液（6 mL：30 mg）購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。

TU1901紫外可見分光光度計（北京普析通用有限公司），DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)有限公司），BS223S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），電熱恒溫箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮有限公司），KDC-2046低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），SHZ-C型循環(huán)水式多用真空泵（河南鞏義市英峪華儀器廠），恒溫水浴鍋、LGJ-18A冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）。CelMate系列CO2培養(yǎng)箱，ESCO貿(mào)易有限公司；YZQ-B恒溫?fù)u床，上海雙舜實業(yè)發(fā)展有限公司；Eppendorf Research移液槍，北京博儀恒業(yè)科技公司；WD-2102A自動酶標(biāo)儀，北京市六一儀器廠。

D101、AB-8大孔樹脂購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；ZTC-1、D3520、NKA-9 大孔樹脂購自南開大學(xué)化工廠。參考廠家提供的信息對大孔樹脂的理化性質(zhì)總結(jié)如下（表1）。

2 通關(guān)藤總皂苷提取工藝研究

2.1 總皂苷的提取

表1 大孔吸附樹脂的理化性質(zhì)

以乙醇濃度、加醇量、提取時間和提取次數(shù)作為考察因素，每個因素選取3個水平，以總皂苷含量作為指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗設(shè)計表，優(yōu)化總皂苷提取工藝參數(shù)，以篩選最佳工藝條件及技術(shù)參數(shù)。提取方法是稱取10 g通關(guān)藤藥材，按試驗設(shè)計條件，加熱回流提取后趁熱過濾，提取液減壓濃縮并定容至100 mL，備用。各因素水平見表2。

表2 因素水平表

2.2 對照品溶液的制備

稱取通關(guān)藤苷A對照品10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容，即得1.0 mg/mL通關(guān)藤苷A對照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取 0.04 mL，0.06 mL，0.08 mL，0.10 mL，0.12 mL，0.14 mL 通關(guān)藤苷 A 對照品溶液，分別置于試管中，揮干溶劑，精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液 0.4 mL，高氯酸 0.8 mL，搖勻，置 70 ℃水浴中加熱15 min；取出，立即置于冰水浴中放置5 min，取出，加入10 mL冰醋酸，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，按紫外-可見分光光度法（中國藥典2015年版四部通則0401），于460 nm處測定吸光度，將吸光度A與對照品量C（mg）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為：A=4.494 4C-0.156 5（R=0.999 1），表明通關(guān)藤苷A 濃度在 0.039 8 mg～0.139 4 mg內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 供試品溶液的制備

精密量取提取工藝制備的樣品溶液100 μL，置于具塞試管中，揮干溶劑，按“2.3”項下方法操作，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中通關(guān)藤苷A的量，計算提取液中總皂苷的含量。結(jié)果見表3，表4。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗方差分析

通過直觀分析得出：影響皂苷含量的因素依次為 A＞C＞B＞D，優(yōu)選提取方案為 A2B2C3D3，即：乙醇濃度為70%、加醇量為10倍量、提取時間2 h、提取次數(shù)為4次。從直觀分析結(jié)果可以看出，提取次數(shù)對總皂苷的含量影響甚微，提取3次和4次的差異不明顯。因此，從能源節(jié)約角度選取提取3次作為最優(yōu)工藝。

3 通關(guān)藤總皂苷純化工藝研究

3.1 大孔樹脂的篩選

采用動態(tài)吸附法，將濃度為5.55 mg/mL的通關(guān)藤提取物水溶液分別通過5種不同型號已經(jīng)處理好的大孔吸附樹脂柱（17.5 mL）進(jìn)行動態(tài)吸附。由于測定的通關(guān)藤C21甾體皂苷在222 nm處有最大吸收，故紫外分光光度法在222 nm處檢測流出液吸光度，待反應(yīng)呈陽性時，表明已有甾體皂苷流出，樹脂達(dá)到吸附飽和。停止上樣，計算樹脂的比吸附量。將吸附飽和的樹脂先用蒸餾水洗脫至無色，棄去，再用乙醇洗脫，洗脫至留出液在222 nm處所測定的吸光度值滿足要求，收集洗脫液，蒸干，稱重，計算解析率。結(jié)果見表5。

從通關(guān)藤皂苷的吸附與解析看，AB-8和ZTC-1吸附量相當(dāng)，但從解析率來看，差異較大；D3520和ZTC-1解析率相差不大，但如果要達(dá)到與ZTC-1相同的效果需要投入更多的樹脂才能實現(xiàn)。因此綜合考慮，初步分離純化工藝研究宜采用ZTC-1大孔吸附樹脂作為考察對象。

表5 動態(tài)吸附試驗結(jié)果

3.2 ZTC-1大孔樹脂洗脫曲線考察

量取已處理好的ZTC-1大孔吸附樹脂50 g，裝柱，取5.55 mg/mL的通關(guān)藤提取物水溶液上樣70 mL，待上樣結(jié)束后，依次用水，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇各100 mL進(jìn)行洗脫，收集各部位洗脫液，濃縮置于10 mL量瓶中，取200 μL采用2.3項下方法于460 nm處記錄樣品吸光度，計算總皂苷含量，結(jié)果見表6。

表6 大孔樹脂洗脫曲線

3.3 洗脫劑濃度對皂苷解析率的影響

量取已處理好的ZTC-1大孔吸附樹脂50 g，裝入玻璃層析柱，取1 g通關(guān)藤提取物溶于適量蒸餾水制成水溶液，上樣，待上樣結(jié)束后，用水100 mL洗去雜質(zhì)，收集洗脫液，蒸干，按照2.3項下方法測定總皂苷含量。然后再依次用50%，70%，95%乙醇洗脫至流出液在222 nm處測定的吸光度值滿足要求，收集洗脫液，蒸干，稱重，再按照2.3項下方法測定總皂苷含量，結(jié)果見表7。

表7 洗脫劑濃度對皂苷解析率的影響

由表7可知，95%乙醇洗脫部位雖然增加了總皂苷的量，但相應(yīng)代入的雜質(zhì)增加多于皂苷。鑒于此，以水和50%乙醇用于洗脫雜質(zhì)，收集50%～70%乙醇洗脫部位，以分光光度法計該部位的總皂苷含量高于70%。

3.4 洗脫劑用量的影響

量取已處理好的ZTC-1大孔吸附樹脂50 g，裝入玻璃層析柱，取5.55 mg/mL的通關(guān)藤提取物水溶液上樣70 mL，分別以水和50%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，然后用70%乙醇200 mL洗脫，每2 mL為1個流分，收集洗脫液，于222 nm下測定吸光度值，以洗脫液容量作為橫坐標(biāo)，以測得的吸光度值作為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果見圖1。

圖1 洗脫劑用量的影響

由圖1可知，當(dāng)洗脫劑用量為100 mL時，樣品的吸光度值趨近于零，說明此時樹脂柱吸附的皂苷基本洗脫完全。因此，確定洗脫劑用量為1.5 BV。

4 MTT法檢測通關(guān)藤總皂苷對細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入適量胰酶消化液，使貼壁細(xì)胞脫落，用15 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配置成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL。用臺盼藍(lán)染色后在計數(shù)板上作細(xì)胞計數(shù)，不著色的活細(xì)胞在97%以上。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱，在37℃，5%CO2條件下，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將受試藥物通關(guān)藤總皂苷和陽性對照藥物順鉑注射液配置成高、中、低3個濃度，每孔加藥10 μL，每個濃度3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱，在37℃，5%CO2條件下，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時與實驗孔平行設(shè)置只加培養(yǎng)基的陰性對照孔和不加細(xì)胞，只加DMEM培養(yǎng)基的空白孔。孵育培養(yǎng)48 h后，用PBS小心清洗培養(yǎng)板，加入用DMEM培養(yǎng)基配置的1 mg/mLMTT溶液，在37℃，5%CO2條件下，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使MTT還原。小心吸取孔內(nèi)上清液，棄去，每孔加入 150 μL DMSO，震蕩 10 min，使結(jié)晶物溶解。以空白孔調(diào)零，采用自動酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測各孔吸光度A值。按照下述公式計算抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=［1-（A給藥組-A空白孔）/（A陰性對照組-A空白孔）］×100%。以LOGIT法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，通關(guān)藤總皂苷對人肝癌細(xì)胞Hepg2具有抑制作用，高濃度組與空白對照比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)提取物濃度大于0.312 mg/mL時，人肝癌細(xì)胞Hepg2的抑制率為48.2%，且隨著藥物劑量的增大其差異更為顯著。通關(guān)藤總皂苷的IC50值為0.840 0 mg/mL。結(jié)果見表8、圖2。

表8 不同受試物對人肝癌細(xì)胞Hepg2的抑制作用

圖2 藥物作用后觀察細(xì)胞形態(tài)（×120）

5 討論

由于通關(guān)藤提取物為70%乙醇提取所得，在用大孔樹脂純化時需要用水進(jìn)行溶解，在此過程中會產(chǎn)生一定量的不溶物。因此本研究對加入水溶解的用量進(jìn)行比較，明確了當(dāng)加水量達(dá)到15倍后，水量增加于皂苷的溶解影響不大，且產(chǎn)生的不溶物中的皂苷含量最少，所以最終確定上樣濃度為1 g通關(guān)藤提取物（相當(dāng)于生藥量為12.5 g）加入180 mL水進(jìn)行溶解。

通過對5種大孔吸附樹脂的吸附研究，發(fā)現(xiàn)ZTC-1型大孔吸附樹脂較適合通關(guān)藤總皂苷的純化，是一種比較理想的樹脂，具有吸附量大、解吸率高、操作簡便、重復(fù)性好、消耗少等優(yōu)點，因此具有較好的推廣應(yīng)用前景。