羅卉卉，金素鈺，黃 林，鄭玉才

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

乳中的體細(xì)胞主要包括白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量乳腺上皮細(xì)胞[1].健康奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)量約2×104～2×105個(gè)/mL[2]，雖然遠(yuǎn)低于血液中的白細(xì)胞濃度（通常為4×106～10×106個(gè)/mL），但仍能用于提取DNA[3-4].乳中提取DNA的方法有很多.Volk等人[5]采用苯酚—氯仿法從2 mL牛乳中提取DNA，方法中使用了氯仿、異丙醇等有害試劑，且實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)；崔艷華[6]采用鹽析法從50 mL牦牛乳中提取DNA，提取步驟較為復(fù)雜；Liu等人[7]采用丙酮法和SDS—苯酚法從13 mL牛乳中提取DNA；Psifidi等人[8]采用商業(yè)試劑盒法提取乳中DNA，但試劑較昂貴.綜上所述，目前從牛乳中提取DNA的方法往往耗時(shí)較長(zhǎng)、試劑價(jià)格高，并且需要較大體積的牛乳（2 mL～50 mL），有時(shí)還會(huì)使用有害試劑而影響操作人員或環(huán)境.

Amills等（1997）報(bào)道了利用Chelex-100方法從乳中快速提取基因組DNA，用于擴(kuò)增一些核基因.由于線粒體DNA常被運(yùn)用于疾病診斷、遺傳等分析[9]，本研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速、無毒且廉價(jià)的從少量牦牛乳中分離總DNA的方法，擴(kuò)增線粒體DNA的D-loop區(qū)和細(xì)胞色素b基因（Cytb）.

1 材料與方法

1.1 乳樣的采集和處理

麥洼牦牛（Bos grunniens）乳樣采自四川省紅原縣.于7月份泌乳高峰季節(jié)，在早晨對(duì)全奶麥洼牦牛（采樣當(dāng)年產(chǎn)犢）和半奶麥洼牦牛（采樣前一年產(chǎn)犢）各10頭手工擠乳，每頭采集約50 mL全乳，冰凍后用冰瓶帶回實(shí)驗(yàn)室.

每個(gè)乳樣取部分以800 g于4℃離心20 min，制備的脫脂乳分裝.所有樣品均保存于-80℃.實(shí)驗(yàn)時(shí)全乳和脫脂乳樣品已保存約2年.

1.2 牦牛乳中DNA的提取

參考Amills等[10]的方法，采用 Chelex-100提取麥洼牦牛全乳和脫脂乳中的DNA.主要過程:取20 μL全乳或脫脂乳加入到980 μL超純水中，渦旋15 s，再以12000 g室溫離心3 min；沉淀用100 μL的5%Chelex-100（Bio-Rad，美國）重懸，再加入 4 μL 的 10 mg/mL新鮮蛋白酶K（Bio-Froxx，德國），56℃金屬浴55 min后，于沸水浴中變性8 min，冷卻后于-20℃保存.

1.3 用PCR擴(kuò)增線粒體DNA兩個(gè)基因序列

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中普通?；蚪M序列（登錄號(hào):NC＿006853.1），用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增線粒體DNA的D-loop區(qū)的PCR引物.Cytb基因的引物參考胡強(qiáng)等的報(bào)道[11].D-loop-F:ccatcaacccccaaagctgaagttc， D-loop-R:caggaaggctgggaccaaacctatg； cytb-F:taccatgaggacaaatatcattctg，cytb-R:cctcctagtttgttagggattgatcg.預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)分別為1045 bp和472 bp.引物由擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成.

以乳中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR儀，Bio-Rad）.D-loop和 Cytb基因的 PCR反應(yīng)體系（25 μL）:DNA 模板2 μL，上、下游引物（10 μM）各 1 μL，Golden Star T6 Super PCR Mix（擎科梓熙）21 μL.PCR擴(kuò)增程序:98℃ 預(yù)變性3 min；98℃變性30 s，退火（溫度:D-loop為60℃，Cytb基因?yàn)?5℃）30 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

為比較全乳與脫脂乳、全奶與半奶牦牛乳提取DNA的PCR擴(kuò)增差異，取全乳、脫脂乳提取的DNA各6個(gè)，及全奶牦牛乳、半奶牦牛乳提取的DNA各6個(gè)，分別擴(kuò)增Cytb基因，比較PCR擴(kuò)增效果.同時(shí)，取全奶牦牛全乳提取的DNA兩個(gè)，分別擴(kuò)增35、40、45、50、55個(gè)循環(huán)，比較不同循環(huán)數(shù)PCR擴(kuò)增效果.

1.4 PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序

為檢驗(yàn)乳中提取DNA的PCR產(chǎn)物是否可用于后續(xù)研究，將乳中提取DNA擴(kuò)增Cytb基因的PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由生工生物工程有限公司進(jìn)行產(chǎn)物直接測(cè)序.獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中普通?；蚪M序列（登錄號(hào):NC＿006853.1）進(jìn)行比對(duì).

2 結(jié)果

2.1 乳中DNA的提取及線粒體DNA的PCR擴(kuò)增

以麥洼牦牛（n＝10）全乳中提取的DNA為模板，用PCR擴(kuò)增線粒體 D-loop區(qū)和Cytb基因的部分片段，瓊脂糖凝膠電泳可顯示與預(yù)期片段大小相符的、特異的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，條帶亮度較大，無雜帶（圖1）.但個(gè)體間的擴(kuò)增效率存在差異（如圖1B中，Q4和Q10樣品擴(kuò)增條帶較暗）.

2.2 不同牦牛乳DNA對(duì)PCR擴(kuò)增Cytb基因的影響

以半奶牦牛（n＝6）全乳、脫脂乳提取的DNA為模板，擴(kuò)增Cytb基因效果存在差異（圖2A）.全乳提取DNA擴(kuò)增條帶亮度明顯大于脫脂乳，同時(shí)個(gè)體之間也存在差異.表明Cytb基因的擴(kuò)增可采用全乳，也可采用脫脂乳提取DNA作為模板，但是全乳效果更好.

比較6頭全奶牦牛和6頭半奶牦牛的全乳提取的DNA擴(kuò)增Cytb基因效果，發(fā)現(xiàn)雖然均能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并存在個(gè)體差異，但半奶牦牛乳提取的DNA，擴(kuò)增條帶總體更亮（圖2B）.

2.3 循環(huán)數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增Cytb基因的影響

以2頭全奶牦牛（A和B）全乳提取的DNA為模板，比較循環(huán)數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增Cytb基因的影響.發(fā)現(xiàn)當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)從35增至55時(shí)，條帶亮度增加，但45個(gè)以下循環(huán)的擴(kuò)增條帶亮度較弱（圖3）.

2.4 乳DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序

以乳DNA為模板，PCR擴(kuò)增Cytb基因的產(chǎn)物直接測(cè)序表明，測(cè)序峰圖清晰（圖4），能正確獲得序列.通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中普通?；蚪M序列（登錄號(hào):NC＿006853.1）進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)該基因確實(shí)為Cytb基因，表明擴(kuò)增產(chǎn)物可應(yīng)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn).

圖1 PCR擴(kuò)增牦牛乳源線粒體DNA的D-loop區(qū)和Cytb基因的瓊脂糖凝膠電泳圖（A）和（B）分別為擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)、Cytb基因的結(jié)果.M為DNA Marker；Q1～Q10為10頭全奶牦牛的全乳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of mtDNA D-loop region and Cytb gene amplified using yak milk DNA templates（A）and（B）are the results of amplification of mtDNA D-loop region and Cytb gene from whole milk DNA；M:DNA Marker；Q1 ～ Q10 are the whole milk samples of 10 total lactating yaks

圖2 不同牦牛乳提取DNA擴(kuò)增Cytb基因的瓊脂糖凝膠電泳圖（A）和（B）分別為牦牛脫脂乳和全乳、半奶牦牛和全奶牦牛全乳DNA擴(kuò)增Cytb基因的結(jié)果；M為DNA Marker；BT1～BT6和B1～B6分別為6頭半奶牦牛的脫脂乳和全乳；B1～B6和Q1～Q6分別為半奶牦牛和全奶牦牛不同個(gè)體的全乳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Cytb gene amplified using DNA extracted from different yak milk samples（A） and （B） are the results amplifying the Cytb gene using DNA extracted from yak whole milk and skim milk，and milk of half-lactating yak and total-lactating yak，respectively；M:DNA Marker；BT1 to BT6 and B1 to B6 are skim milk and whole milk of six half-lactating yaks，respectively；B1 ～ B6 and Q1 ～ Q6 are whole milk of half-lactating yaks and total-lactating yaks，respectively

圖3 全奶牦牛全乳DNA在不同循環(huán)數(shù)下擴(kuò)增Cytb基因瓊脂糖凝膠電泳圖M為DNA Marker；A、B為兩個(gè)牦牛樣品，圖下數(shù)字為PCR循環(huán)數(shù).Fig.3 Agarose gel electrophoresis of Cytb gene amplified from whole milk DNA of total-lactating yak at different cyclesM:DNA Marker；A and B are two yak samples.The figure under the map shows the number of PCR cycles.

圖4 全奶牦牛全乳DNA擴(kuò)增細(xì)胞Cytb基因的部分測(cè)序峰圖Fig.4 Sequence peak map of the partial Cytb gene amplified using whole milk DNA of total-lactating yak

3 討論

本研究建立了從牦牛乳中快速提取總DNA擴(kuò)增線粒體Cytb基因、D-loop區(qū)的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，無雜帶，可用于直接測(cè)序并獲得正確的結(jié)果.Amills等人[11]用 Chelex-100法從牛乳中提取了DNA，用于擴(kuò)增細(xì)胞核中的多個(gè)功能基因和微衛(wèi)星序列，并未涉及線粒體基因.而本研究表明，提取的DNA還可用于擴(kuò)增線粒體 DNA，其中 D-loop區(qū)長(zhǎng)度達(dá)1000 bp左右（圖1），產(chǎn)物的進(jìn)一步測(cè)序等可為基于乳樣品的遺傳學(xué)分析提供科學(xué)的數(shù)據(jù).

Chelex-100方法提取的乳DNA在擴(kuò)增時(shí)存在個(gè)體差異，某些樣品在相同條件下擴(kuò)增條帶較淡（圖1 B），這可能與乳中細(xì)胞數(shù)量差異有關(guān).有研究表明，牛乳中體細(xì)胞數(shù)量受許多因素影響，例如品種、產(chǎn)奶量、泌乳階段和個(gè)體差異等[12].Usman[13]等人采用試劑盒方法提取的牛乳DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶亮度也存在明顯的個(gè)體差異.另外，Chelex-100法提取全乳、脫脂乳DNA擴(kuò)增線粒體DNA的Cytb基因或D-loop區(qū)的效果存在明顯差異（圖2A），這可能也與二者的體細(xì)胞數(shù)量差異有關(guān).脫脂乳比全乳中體細(xì)胞數(shù)量低[14].雖然牦牛全乳所提DNA擴(kuò)增效果比脫脂乳好，但脫脂乳也能用于提取DNA.由于脫脂乳更易保存，這擴(kuò)展了基于乳中DNA的PCR分析.類似的機(jī)制也可解釋半奶牦牛乳DNA擴(kuò)增效果好于全奶牦牛的原因.有研究表明，半奶牦牛與產(chǎn)犢當(dāng)年擠乳的全奶牦牛相比，雖然擠乳量顯著下降，但是乳蛋白、乳脂含量極顯著增加[15].因此，半奶牦牛乳更適合用Chelex-100方法提取總DNA.

全奶牦牛全乳提取的DNA在PCR擴(kuò)增Cytb基因時(shí)，45循環(huán)數(shù)以下擴(kuò)增條帶較淡.Amills等人[11]用Chelex-100法從牛乳中提取的DNA在PCR擴(kuò)增45循環(huán)以下時(shí)，擴(kuò)增條帶亮度也不高.結(jié)合本研究結(jié)果，作者認(rèn)為用Chelex-100方法從乳中提取DNA用于PCR時(shí)，其循環(huán)數(shù)應(yīng)大于45個(gè)循環(huán).綜上所述，本研究建立了用Chelex-100方法快速提取牦牛全乳和脫脂乳DNA，并擴(kuò)增線粒體DNA的D-loop區(qū)和Cytb基因的方法，為基于乳的分子遺傳研究提供了可靠的技術(shù).