章 帆 ，閆文德 ，王姣龍 ，李際平

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.深圳市深港產(chǎn)學(xué)研環(huán)保工程技術(shù)股份有限公司，廣東 深圳 518057；3.南方林業(yè)生態(tài)應(yīng)用技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類廣泛存在于自然界中、具有“三致”（ 致癌、致畸、致突變）效應(yīng)的持久性有機(jī)污染物（Persistent Organic Pollutants,POPs）[1-2]，主要來源于煤炭、石油、汽油等有機(jī)高分子化合物的不完全燃燒。近年來，人類的生產(chǎn)活動(dòng)導(dǎo)致了環(huán)境中多環(huán)芳烴含量大幅度增加，直接危害人體健康和國土生態(tài)環(huán)境安全。因此研究如何去除土壤中多環(huán)芳烴，以達(dá)到修復(fù)被污染土壤的目的，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

植物修復(fù)是指利用植物來消除土壤中的有機(jī)毒物和無機(jī)廢物[4]，根系分泌物是指植物在生長過程中由根系分泌產(chǎn)生的無機(jī)離子或小分子有機(jī)物的統(tǒng)稱，它具有改善根際周邊的微環(huán)境，協(xié)調(diào)土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)、加快有機(jī)質(zhì)礦化等獨(dú)特作用[4-5]。研究表明，不同類型的植物根系分泌的物質(zhì)不同，不同的根系分泌物對(duì)多環(huán)芳烴的降解效果也各不相同。楊艷[6]研究了以芘、菲、萘、苊對(duì)黑麥草根系分泌效應(yīng)的影響，結(jié)果在多環(huán)芳烴污染物脅迫下，黑麥草根系分泌物中可溶性有機(jī)酸的含量均高于對(duì)照組，隨著培養(yǎng)液中污染物濃度的升高，可溶性有機(jī)酸等分泌量也隨之增加。謝明吉[7]等通過對(duì)菲處理下黑麥草的根系分泌物中幾種低分子有機(jī)酸的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)黑麥草根系分泌中有機(jī)酸及氨基酸等含量隨菲濃度的升高而變化。王姣龍[8-9]通過對(duì)芘脅迫下4種綠化樹種的根系分泌物成分進(jìn)行分析，得出在不同濃度的芘脅迫下，植物根系分泌物有著不同程度的變化。

本試驗(yàn)采用欒樹Koelreuteria paniculata和樟樹Cinnamomum camphora為研究對(duì)象，以芘為PAHs代表物測(cè)定在不同芘濃度脅迫下2種城市綠化樹種的根系分泌物的組成成分變化、根系活性及其生長形態(tài)的變化。目前植物修復(fù)的綜述文章較多，具體探討植物根系分泌物對(duì)土壤中污染物的修復(fù)機(jī)理的報(bào)告還較少。本研究將探究植物根系分泌物對(duì)土壤中多環(huán)芳烴污染的響應(yīng)作用，也為進(jìn)一步探討根系分泌物在多環(huán)芳烴污染物降解過程的機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究于2015年9月在中南林業(yè)科技大學(xué)生態(tài)應(yīng)用技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。欒樹和樟樹2個(gè)樹種是我國南方城市常見的綠化樹種，欒樹（闊葉落葉樹種）喜光耐寒，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)[10]。樟樹（闊葉常綠樹種）枝葉茂盛，樹形優(yōu)美常被作為綠化行道及防風(fēng)林[11]。污染物選取南方城市環(huán)境中常見的芘為多環(huán)芳烴代表物。將芘試劑（＞97%）溶于丙酮溶液中，與石英砂按照一定比例均勻混合。配置完成后，置于通風(fēng)廚內(nèi)待丙酮揮發(fā)完全。共設(shè)置3個(gè)芘濃度（L0：0 mg/kg對(duì)照處理；L1：500 mg/kg低濃度處理；L2：2 000 mg/kg高濃度處理；濃度參考土壤中多環(huán)芳烴濃度[12-14]），每組3重復(fù)。

選取1年生樟樹實(shí)木苗，苗高，地徑基本保持一致（欒樹苗高約43.7 cm，地徑約0.35 cm；樟樹苗高約為55.7 cm，地徑約0.49 cm），將植物根系整理后浸入0.15%的福爾馬林溶液中滅菌，用蒸餾水沖洗根部表面（不破壞根），移植到裝有1 kg石英砂的Φ8 cm塑料盆中。每盆1株，共18盆。定期澆水，移動(dòng)盆栽位置，保證每盆植株生長環(huán)境基本一致。

1.2 根系分泌物收集

培養(yǎng)50 d后，用清水沖洗幼苗根部（不損壞根部結(jié)構(gòu)），再用去離子水浸泡大約3 min（加少量百里酚溶液抑制微生物活動(dòng)）。以3株幼苗為單元置于1 000 mL 0.5 mmol/L CaCl2的燒杯中，滴3～5滴百里酚抑菌，再用錫箔紙包裹燒杯，保持燒杯口通氣狀態(tài)，培養(yǎng)24 h，過濾后保存到冰箱，待測(cè)。

1.3 根系分泌物成分GC-MS分析

將收集的1 000 mL待測(cè)液減壓至50 mL，加入100 mL CH2Cl2，振蕩6 h，重復(fù)3次，將3次溶劑合并，減壓濃縮至干，滴加2 mLCH2Cl2（過0.45 μm膜），移液至玻璃取樣瓶中（保存在-20℃冰箱）。測(cè)定儀器：GC-MS型號(hào)為GC6890/MS5973氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，毛細(xì)管柱DB-5 ms，進(jìn)樣口溫度為 280 ℃，柱溫為 50 ℃，保持時(shí)間為 3 min，以 10 ℃·min-1程序升溫至290 ℃，保持時(shí)間為20 min，使用的載氣為He，以0.2 s速度掃全程，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為250 ℃，使用面積歸一化法測(cè)定。

1.4 根系分泌物中TC、TN含量

取30 mL待測(cè)液使用島津TOC-500測(cè)定儀測(cè)定。

1.5 根活力的測(cè)定

采用甲稀藍(lán)法[15]測(cè)定。用排水法測(cè)量根體積，用濾紙吸干根系表面水分，浸入根體積10倍的甲稀藍(lán)溶液（0.000 2 mol/L）中1.5 min取出，吸取1 mL甲基藍(lán)溶液，稀釋10倍。選擇波長為660 nm，以純水為參照對(duì)比在分光光度計(jì)下比色，讀出光的密度。

總吸收面積 (m2) = [(C1-C1′)×Vl]+[(C2-C2′)×V2]×l.l；

活躍吸收面積 (m2) = [(C3-C3′)×V3]× l.l。

式中：C為溶液原來的濃度mg·mL-1；C′為浸提后的濃度mg·mL-1；1,2,3為離心管編號(hào)。

1.6 酸性磷酸酶活性的測(cè)定

根系酸性磷酸酶活性的測(cè)定采用Mclanchlan法[16]。將植物根系侵入約為其體積10倍的以醋酸鈉緩沖液（0.2 mol·L-1，pH值約5.8）為溶劑的對(duì)硝基苯磷酸二鈉（0.5 g·L-1）酶反應(yīng)液，用錫箔紙包裹。常溫培養(yǎng)60 min，取出加入1 mL NaOH溶液終止酶促反應(yīng)，空白處不放植物根系，以空白為對(duì)比，波長660 nm分光光度。

酶活性 nmol·g-1min-1= 試樣A/(0.019×T×W)×V總。

式中：A為試樣的吸光度，0.019為pH值為14時(shí)，對(duì)硝基酚的μmol吸光系數(shù)。

式中：V1為反應(yīng)液體積；V2為NaOH體積；T為時(shí)間；FW為根鮮質(zhì)量。

1.7 根系生長指標(biāo)的測(cè)定

直尺及游標(biāo)卡尺計(jì)算欒樹、樟樹的苗高和地徑（地面以上20 cm處直徑）

1.8 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件處理，使用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05，差異性顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物的成分分析

由表1、2可見，對(duì)照組，欒樹根系分泌物中共檢測(cè)到15種化合物，其中包括7種烷烴類、4種烯烴、3種雜環(huán)類化合物以及1種酚醛類。經(jīng)L1處理下，根系分泌物中共檢測(cè)到20種化合物，其中9種烷烴、3種烯烴、2種雜環(huán)類、3種苯類、1種酯類以及芘類。經(jīng)L2處理下，根系分泌物中共檢測(cè)到19種化合物，其中6種烷烴、3種硅氧烷、3種烯烴、2種雜環(huán)類、1種酯類及芘類?？瞻捉M，樟樹根系分泌物中共檢測(cè)到7種化合物，其中3種烷烴類、2種雜環(huán)類、1種酚醛類和1種烯烴。經(jīng)L1處理，樟樹根系分泌物中共檢測(cè)到14種化合物，其中包括7種烷烴、2種烯烴、2種雜環(huán)類化合物、1種酚醛類以及芘。經(jīng)L2處理，根系分泌物中共檢測(cè)到10種化合物，其中包括5種雜環(huán)類、2種烷烴、1種酯類、1種硅氧烷以及芘類。

表1 3種不同水平處理欒樹根系分泌物中化學(xué)成分的對(duì)比分析Table 1 Comparison of component analysis of root exudate of Koelreuteria paniculata under three levels

續(xù)表1Continuation of table 1

表2 3種處理水平下樟樹根系分泌物中化學(xué)成分的比較Table 2 Comparison of component analysis of root exudate of Cinnamomum camphora under three levels

經(jīng)L1處理，從欒樹、樟樹根系分泌物中檢測(cè)到含量較高的為烷烴類、雜環(huán)類及芘類，其中檢測(cè)到芘類的質(zhì)量比分別為：13.62%、19.50%，烷烴類質(zhì)量比分別為：33.71%、41.68%，雜環(huán)類化合物質(zhì)量比分別為：12.21%、9.64%。十七烷、二十烷、1-十九烯、二十三烷、3-羧胺吡啶-N-（2-三氟甲苯基）胺肟這5類化合物在欒樹樟樹根系分泌物中均檢測(cè)到。經(jīng)L3處理，從欒樹、樟樹根系分泌物共檢測(cè)到含量較高的有芘類、硅氧烷類，芘類質(zhì)量比分別為：17.65%、42.71%，檢測(cè)到硅氧烷類質(zhì)量比分別為：30.89%、20.90%。

2.2 根活力分析

如圖1-a，欒樹根系總吸收面積范圍為5.24～6.57 m2（見圖1-a），樟樹根系總吸收面積范圍為3.90～5.26 m2。經(jīng)L1和L2處理下欒樹和樟樹的根系總吸收面積均大于對(duì)照組，欒樹經(jīng)L2處理后吸收面積達(dá)到最大，L0處理與L1、L2處理之間差異性顯著（P＜0.05），樟樹經(jīng)L1處理吸收面積達(dá)到最大，L0處理與L1、L2處理之間差異性顯著（P＜0.05）。

欒樹根活躍吸收面積范圍為2.74～3.43 m2（見圖1-b），樟樹根活躍吸收面積范圍為2.67～3.04 m2（見圖1-b），欒樹和樟樹經(jīng)L0處理下根系活躍總吸收面積最小，欒樹根活躍吸收面積經(jīng)L2處理下達(dá)到最大，L0處理與L1、L2處理下差異性顯著（P＜0.05），樟樹經(jīng)L1處理后根活性總吸收面積為最大，不同處理水平之間無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同芘處理根系總吸收面積、根活躍吸收面積Fig.1 Root acid absorption area and root acid phosphates activity in different pyrene treatments

欒樹根系磷酸酶活性范圍為62.96～69.56 nmol·g-1min-1，樟樹根系磷酸酶活性范圍為8.80～10.46 nmol·g-1min-1（見圖2），欒樹根系磷酸酶活性吸收面積經(jīng)L1、L2處理后均大于對(duì)照組，L2處理后吸收面積最大，不同水平處理之間無顯著差異（P＞0.05）。樟樹經(jīng)L1處理下吸收面積最小，L2處理后吸收面積達(dá)到最大，不同處理之間沒有顯著差異（P＞0.05）。欒樹根系磷酸酶活性隨著芘濃度升高吸收面積逐漸增大，樟樹呈先下降后上升規(guī)律。

2.3 根系分泌物的TC、TN含量

如圖3-a所示，欒樹根系分泌物中測(cè)得總碳含量為9.80～28.78 mg/L， 大小為L0＞L1＞L2，總碳含量隨芘濃度的升高，逐漸下降，各處理水平之間均存在顯著性差異（P＜0.05）；樟樹根系分泌物中測(cè)得總碳含量范圍為4.86～9.44 mg/L，大小順序?yàn)椋篖2＞L0＞L1，總碳含量隨污染物濃度升高，出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，各處理水平之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 不同濃度處理磷酸酶活性吸收面積Fig.2 The influence of the phosphatase activity in different pyrene treatments

圖3-b可見，欒樹根系分泌物中總氮含量范圍為4.42～7.59 mg/L，大小順序?yàn)椋篖1＞L0＞L2，隨芘濃度的升高，總氮含量先上升后下降。L0處理與L1處理之間不存在顯著差異性（P＞0.05），L2處理分別與L0處理和L1處理之間存在顯著差異（P＜0.05）。樟樹根系分泌物中總氮含量范圍為1.59～5.55 mg/L（見圖3），隨芘濃度的上升，根系分泌物中總氮含量呈先下降后上升趨勢(shì)，大小順序?yàn)椋篖0＞L2＞L1，各處理之間均存在顯著差異（P＜0.05）。

2.4 植物苗高地徑分析

如圖4-a，欒樹在不同濃度芘處理下苗高范圍為43.7～63.93 cm，地徑范圍為0.35～0.48 cm。圖4-b樟樹苗高范圍為55.7～69.63 cm，地徑范圍為0.49～0.62 cm（見圖4）。欒樹苗高及地徑在L1處理下達(dá)到最大值，且L1處理水平下的苗高與其余處理水平間存在顯著差異（P＜0.05）。樟樹苗高和地徑經(jīng)L1處理下為最大，苗高經(jīng)L0處理與L1、L2處理差異性顯著（P＜0.05），地徑經(jīng)L1處理下與L0、L2處理之間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖3 不同芘濃度處理下根系分泌物中TC、TN含量Fig.3 Contents of TC and TN in root exudates treated with different pyrene concentrations

圖4 不同芘濃度處理下植物苗高、地徑Fig.4 Seedlings height and ground diameter with different pyrene concentrations

3 討 論

3.1 不同濃度芘脅迫對(duì)根系分泌物成分及比重的影響

根系分泌物是植物體利用地下部分和環(huán)境之間進(jìn)行能量、物質(zhì)及信息交換傳遞的重要媒介，其分泌產(chǎn)物能改變根際生態(tài)環(huán)境，并對(duì)周圍土壤環(huán)境產(chǎn)生影響，任何環(huán)境改變都會(huì)影響植物根系分泌物的種類和數(shù)量[17]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同芘濃度脅迫下，明顯改變了植物根系分泌物的組成成分及所占比例，與王姣龍[18]試驗(yàn)的紫玉蘭根系分泌物在芘脅迫下成分均發(fā)生明顯變化的研究結(jié)果相似。隨著添加芘污染物濃度的升高，從根系分泌物中檢測(cè)到芘含量也不斷增加，說明植物根系對(duì)土壤中芘污染物有一定的吸收和富集作用。和郜紅建等[19]研究了植物對(duì)土壤和水中的菲與芘的吸收能力，發(fā)現(xiàn)PAHs污染物主要被植物的根部吸收并富集。許超等[20]研究了芘處理下對(duì)玉米根系分泌的影響，發(fā)現(xiàn)種植玉米對(duì)芘的降解率在低濃度處理下為36%，高濃度在處理下為28.2%，均能促進(jìn)土壤中芘的降解。以上研究都證明了植物根系分泌物能幫助土壤中多環(huán)芳烴的降解。但本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)土壤中剩余芘含量，后期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)添加檢測(cè)剩余污染物的含量，更好的證明植物根系對(duì)污染物的降解作用。

3.2 不同濃度芘脅迫對(duì)植物根系活性的影響

測(cè)定根系活性吸收面積、TC、TN含量及磷酸酶活性吸收面積，目的是為了研究植物根部在土壤中的吸收能力及根系分泌物的變化情況。欒樹和樟樹根系總吸收面積和活躍吸收面積在芘脅迫下均大于對(duì)照組；欒樹TC含量逐漸上升，樟樹先下降后上升；欒樹TN含量先下下降后上升，樟樹持續(xù)下降。本研究證明，芘脅迫下能促進(jìn)根部活性吸收，與張力[21]實(shí)驗(yàn)樟樹幼苗植物根系分泌物在多環(huán)芳烴的脅迫下，TOC、TN含量較其他濃度下值為最大，說明多環(huán)芳烴的添加對(duì)根系分泌能力有提高作用的結(jié)果相似。楊艷[22]等研究了4種PAHs對(duì)黑麥草根系分泌物的可溶性有機(jī)碳的影響，說明了多環(huán)芳烴脅迫下促進(jìn)了根系的分泌作用，可溶性有機(jī)碳含量均高于對(duì)照組。這主要與細(xì)胞膜的選擇透過性有關(guān)，當(dāng)污染物侵害植物時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)做出應(yīng)激反應(yīng)，膜的選擇透過性會(huì)發(fā)生改變[23]，從而引起植物根系分泌發(fā)生不同變化。而在污染物的脅迫下，植物根系分泌物具體的生理反應(yīng)還有待進(jìn)一步的研究證明。

3.3 不同濃度芘脅迫下對(duì)植物生長狀況的影響

L1處理下，對(duì)欒樹、樟樹的生長有一定的促進(jìn)作用，經(jīng)L2處理有抑制作用。欒樹經(jīng)L1處理，苗高、地徑均高于對(duì)照組和L2處理組；經(jīng)L2處理，苗高、地徑均低于L1處理。樟樹經(jīng)L2處理下，苗高高于對(duì)照組及L1處理（約3 cm），地徑低于L1處理。樟樹及欒樹苗高在不同濃度脅迫下，生長狀況不同，可能是由于樟樹較欒樹更為耐受。這一研究現(xiàn)象與其他學(xué)者相似，陸志強(qiáng)[24]等在沙培秋茄幼苗時(shí)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)濃度為0.l mg/L（低濃度）時(shí)芘和萘明顯促進(jìn)幼苗生長，當(dāng)濃度升高到10 mg/L，幼苗苗高顯著降低；沈小明[25]等研究發(fā)現(xiàn)菲脅迫影響玉米的生長狀況，濃度為l mg/L時(shí)玉米的生物量增加，當(dāng)濃度增加至5 mg/L以上時(shí)其長勢(shì)受到抑制。以上現(xiàn)象可能是因?yàn)槎喹h(huán)芳烴化合物是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與某些能促進(jìn)植物的生長激素相類似[25]，所以低濃度下的多環(huán)芳烴能促進(jìn)植物生長。

4 結(jié) 論

在不同濃度芘脅迫下，從植物根系分泌物中均檢測(cè)到芘，且隨著污染物濃度的升高，芘所占比重不斷增大，說明植物根部對(duì)芘污染物有一定的吸附能力。該實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)砂石中剩余的芘含量，可以更科學(xué)的說明植物對(duì)污染物的降解功能，后期還有待更近一步研究試驗(yàn)。污染物的添加一定程度的促進(jìn)了根部活動(dòng)，影響其活性，后期可以檢測(cè)植物根系分泌物的微生物生物量碳，進(jìn)一步研究植物根系在受到脅迫時(shí)的反應(yīng)。低濃度污染物的脅迫可以促進(jìn)植物體的生長，高濃度脅迫會(huì)抑制植物生長。對(duì)比兩種綠化樹種可見，樟樹對(duì)芘脅迫的耐受性優(yōu)于欒樹，本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究植物根系分泌物對(duì)PAHs污染脅迫提供基礎(chǔ)理論，為城市建設(shè)綠化樹種的選擇提供科學(xué)依據(jù)。