侯 悅 石金剛 李 德 張麗萍 王占黎 靳 敏

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

香青蘭(Dracocephalum MoldavicaL.)為蒙古族習(xí)用藥材，青蘭屬唇形科一年生草本植物，在內(nèi)蒙古、甘肅、青海及新疆等省份均有分布[1]。因其較高藥用價(jià)值，蒙香青蘭在蒙醫(yī)臨床中應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代研究表明，該藥材具有緩解心絞痛癥狀,抑制心肌缺血再灌注損傷,抗脂質(zhì)過氧化損傷等作用[2]。香青蘭全草中含有酚類、黃酮類、萜類和微量元素等物質(zhì)[3]。其中酚類物質(zhì)具有抗氧化、強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂肪等作用，這與蒙香青蘭的藥理作用密切相關(guān)[4]。本文對(duì)蒙香青蘭中總酚含量的測定方法進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步研究蒙香青蘭中酚類物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

植物中總酚含量的測定方法主要為福林酚比色法[5]。文獻(xiàn)查閱得出，不同植物的福林酚比色法檢測條件存在較大差異[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過單因素結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法，以吸光度為指標(biāo)，對(duì)福林酚比色法測定蒙香青蘭總酚含量的方法進(jìn)行優(yōu)化，最后通過方法學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性及合理性[7-8]。

1 材料與儀器

1.1 儀器與設(shè)備 UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)(SHIMADZU)，T6新悅-可見分光光度計(jì)(普析通用)，DFX-4C200克密封型搖擺式粉碎機(jī)(廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司)，JB-60D數(shù)顯恒速攪拌機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上?？坪銓?shí)驗(yàn)發(fā)展有限公司)，SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵(上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)，RE-2000ARE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，TYXH-I漩渦混合器(姜堰市天儀電子儀器有限公司)，天馬FA2004電子天平，雙嘉冷凍干燥機(jī)，BSV10油旋片式真空泵(寧波鮑斯能源裝備股份有限公司)

1.2 材料與試劑 蒙香青蘭全草2015年8月購買于內(nèi)蒙古通遼市，全草用電動(dòng)粉碎機(jī)制成粉末，裝于塑料袋，放置于干燥陰暗處備用。

福林酚試劑(SIGMA公司)，DMSO(SIGMA公司)，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20150409)，碳酸鈉，乙醇，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯等試劑均為國產(chǎn)分析純，去離子水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蒙香青蘭總酚提取物的制備 取適量干燥的蒙香青蘭植物粉末，用40%乙醇，于65℃下提取兩小時(shí)，過濾得總酚提取液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得乙酸乙酯提取物，旋干并凍干，得到干燥的蒙香青蘭總酚提取物粉末備用。

2.2 初定反應(yīng)體系 預(yù)實(shí)驗(yàn)中蒙香青蘭總酚的反應(yīng)體系暫定為：取2.1中的蒙香青蘭總酚提取物溶于DMSO，配成2.0mg/mL的蒙香青蘭總酚試液。后取0.05mL試液于10mL比色管中，加入3.95mL去離子水漩渦混勻后，再加入0.25mL福林酚試劑，漩渦混勻并避光靜置5min。之后加入20%碳酸鈉0.8mL，漩渦混勻后加去離子水定容至10mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)150min，在一定波長下測吸光度[9]。

2.3 最大吸收波長的確定 取適量蒙香青蘭總酚試液及沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照2.2顯色反應(yīng)，在500～800nm進(jìn)行全波段掃描，以確定最大吸收波長。

2.4 影響蒙香青蘭總酚含量測定的單因素考察 分別以福林酚試劑的體積(mL)、20%碳酸鈉溶液的體積(mL)、水浴溫度(℃)、水浴時(shí)間(min)為單一自變量，固定其他變量，以吸光度為因變量，對(duì)單因素進(jìn)行考察分析。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的考察因素確定為：福林酚試劑體積(A)、20%碳酸鈉溶液的體積(B)、水浴溫度(C)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，分別以各因素在單因素實(shí)驗(yàn)中得到的最佳值為中心，圍繞最佳值上下各取1個(gè)水平作為響應(yīng)面的水平，以吸光度為考察指標(biāo)，具體見表1。

2.6 方法評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn) 通過重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及回收率實(shí)驗(yàn)等方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平及編碼值

3 結(jié)果與討論

3.1 最大吸收波長的確定 參照2.3的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行最大吸收波長的測定，結(jié)果表明，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和蒙香青蘭總酚試液均在760nm波長處有最大吸收，所以選擇檢測波長為760nm。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 水浴時(shí)間及溫度對(duì)蒙香青蘭總酚含量測定的影響 由圖1(A)可知，25℃、35℃、40℃、45℃下，吸光度隨水浴時(shí)間的延長而逐漸增大，無相對(duì)穩(wěn)定時(shí)間；50℃、55℃下，從水浴時(shí)間30min開始，吸光度呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，且55℃時(shí)吸光度高于50℃吸光度。60℃下，吸光度隨水浴時(shí)間的延長而逐漸降低，無相對(duì)穩(wěn)定時(shí)間。因此，為方便實(shí)驗(yàn)測定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選定水浴溫度為55℃，水浴時(shí)間為30min。

3.2.2 福林試劑用量對(duì)蒙香青蘭總酚含量測定的影響 由圖1(B)可知，隨著福林試劑體積的增加，吸光度值變化明顯。當(dāng)福林試劑體積為0.5mL，吸光度達(dá)到最大。因此，福林試劑體積選定為0.5mL。

3.2.3 碳酸鈉試劑用量對(duì)蒙香青蘭總酚含量測定的影響 由圖1(C)可知，隨著20%碳酸鈉體積的增加，吸光度值呈現(xiàn)先逐漸增加后下降的趨勢(shì)，在碳酸鈉體積為0.9mL時(shí)，吸光度出現(xiàn)最大值。因此，20%碳酸鈉體積選為0.9mL。

綜上分析，單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果為：福林酚試劑體積0.5mL，碳酸鈉溶液體積為0.9mL，且水浴時(shí)間30min，水浴溫度55℃時(shí)，反應(yīng)體系穩(wěn)定且靈敏度較好。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

3.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 按照2.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本試驗(yàn)共含有17個(gè)試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到綜合評(píng)分結(jié)果對(duì)A,B和C的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：Y=0.42+6.163*10-3A+0.055*B+4.075*10-3C+0.018AB+0.014AC-8.425*10-3BC-0.026A2-0.071B2-0.010C2。利用Design-Expert8.0.6軟件，進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來判斷，概率P值越小，相應(yīng)的變量顯著程度就越高。由方差分析結(jié)果可知，此模型P值<0.01，表明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合極顯著，可用來響應(yīng)值預(yù)測；失擬項(xiàng)F值為1.07，P=0.4546>0.05，不顯著，說明實(shí)測值與預(yù)測值之間無失擬存在,實(shí)驗(yàn)誤差小，本實(shí)驗(yàn)無其他顯著性因素的影響，因此模型成立，可以用于指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。由F值大小可推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序?yàn)锽>A>C，其中B因素(碳酸鈉體積)P<0.01，表明B因素極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、C因素對(duì)響應(yīng)值影響不大。A2、B2項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值極顯著(P<0.01)，AB項(xiàng)影響顯著(0.01

3.3.2 二次擬合響應(yīng)面分析 繪制響應(yīng)面3D曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，可以直觀反映出各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，如圖2所示。

從響應(yīng)曲面圖可以看出，每個(gè)曲面都存在最高點(diǎn)。圖中可以看出當(dāng)福林體積為0.60mL左右，碳酸鈉體積為1.20mL左右溫度在54～58℃范圍內(nèi)，響應(yīng)面趨于頂點(diǎn)位置，吸光度的值最高。圖2(A)顯示，吸光度隨福林體積的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，隨碳酸鈉體積的增加先快速上升后緩慢下降，與方差分析結(jié)果相同，且碳酸鈉體積對(duì)吸光度的影響較為顯著。圖2(B)顯示，吸光度值隨福林體積的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，隨溫度的增加有不明顯的先增后減的趨勢(shì)，福林體積對(duì)吸光度值的影響較為顯著。圖2(C)顯示，吸光度值隨碳酸鈉體積的增加呈現(xiàn)先快速上升后緩慢下降的趨勢(shì)，隨溫度的增加先緩慢增加，后逐漸趨于平緩的趨勢(shì)，二者交互作用較為顯著，碳酸鈉體積對(duì)吸光度的影響較為顯著。由此可知，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序?yàn)樘妓徕c體積>福林體積>溫度，與方差分析結(jié)果顯示相同。

圖2

3.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)軟件分析所得的結(jié)果，得到蒙香青蘭總酚含量的最優(yōu)檢測條件為：福林試劑體積為0.62mL，20%碳酸鈉溶液體積1.22mL，水浴溫度55℃，在該條件下，吸光度的預(yù)測值為0.4309，該優(yōu)化檢測條件與響應(yīng)曲面圖結(jié)果吻合。考慮實(shí)驗(yàn)的可行性，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在福林試劑體積為0.60mL，20%碳酸鈉溶液體積1.20mL，水浴溫度為55℃的條件下，進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，所測得的吸光度平均值為0.4254，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.20%，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為1.28%，說明該模型具有

很好的預(yù)測性，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3.4 測定方法評(píng)價(jià)

3.4.1 線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確配制不同濃度的沒食子酸溶液及不同濃度的蒙香青蘭提取物溶液，按照上述優(yōu)化結(jié)果分別測量吸光度值，得到線性回歸方程分別為：Y=173.12X-0.1449(R2=0.9978)，Y=0.1001X+0.0912(R2=0.9943)。結(jié)果表明沒食子酸及樣品溶液濃度分別在0.2-1.0mg/mL及1.0-3.0mg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。

3.4.2 重復(fù)性考察 按已確定的最適條件，準(zhǔn)確量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2個(gè)濃度，體積為0.05mL的蒙香青蘭總酚試液各1份，由同一分析人員在760nm波長處平行測定5次吸光度，結(jié)果得：1.0mg/mL時(shí)吸光度平均值為0.1892，SD為0.000245，RSD為0.13%。3.0mg/mL時(shí)吸光度平均值為0.6036，SD為0.000316，RSD為0.05%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.3 重現(xiàn)性考察 按已確定的最適條件，準(zhǔn)確量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2個(gè)濃度，體積為0.05mL的蒙香青蘭總酚試液各1份，由不同實(shí)驗(yàn)儀器，不同分析人員在760nm波長處平行測定5次吸光度，結(jié)果得：1.0mg/mL時(shí)吸光度平均值為0.196，SD為0.000866，RSD為0.44%。3.0mg/mL時(shí)吸光度平均值為0.611，SD為0.000707，RSD為0.12%。表明該方法重現(xiàn)性良好。

3.4.4 穩(wěn)定性考察 按已確定的最適條件，準(zhǔn)確量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2個(gè)濃度，體積為0.05mL的蒙香青蘭總酚試液各1份，從30min開始，每隔10min在760nm波長處測定吸光度，連續(xù)測定3次。結(jié)果得：1.0mg/mL時(shí)吸光度平均值為0.2030，SD為0.006756，RSD為3.33%。3.0mg/mL時(shí)吸光度平均值為0.5894，SD為0.002946，RSD為0.50%。表明低濃度樣品在50min內(nèi)穩(wěn)定性較差，高濃度樣品在50min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.4.5 加標(biāo)回收率測定 準(zhǔn)確量取5份濃度為1.0mg/mL蒙香青蘭總酚提取液0.05mL，分別加入沒食子酸0.0250mg，按以上實(shí)驗(yàn)確定的最適條件，測定5份樣品的吸光度并計(jì)算混合后的總酚含量。計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

由表2可知，測定5份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.06%，回收率為97.70%，表明該方法相對(duì)可靠，可以用于蒙香青蘭總酚含量的測定。

表2 沒食子酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)

4 結(jié)論

通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和方法評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)得出，香青蘭總酚含量的最優(yōu)檢測條件為：取適量蒙香青蘭總酚提取物，加入3.95mL去離子水漩渦混勻后，再加入0.6mL福林酚試劑，漩渦混勻并避光靜置5min。之后加入20%碳酸鈉1.2mL，漩渦混勻后加去離子水定容至10mL，搖勻，于55℃恒溫水浴箱中避光反應(yīng)30min，在760nm波長測吸光度。該方法操作較為簡便快捷，設(shè)備要求低，重復(fù)性及重現(xiàn)性良好，50min內(nèi)檢測穩(wěn)定性高，回收率為97.70%，可用于測定蒙香青蘭植物中總酚含量。